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第一篇：糖类化合物的分析方法研究进展

作者：林慧 冯云 颜春荣 徐春祥 王岁楼

单位：中国药科大学 江苏省产品质量监督检验研究院

　　摘要：糖类化合物一直被认为是生物结构的重要组成部分和能量来源。近年, 糖类化合物特别是有多重生物功能的糖类化合物, 引起了人们的广泛关注。糖类化合物的分析方法是糖类研究的重要领域之一, 多种分离分析技术联用成为糖类化合物分析方法的发展方向。本文综述了糖类分析常用的分离和检测方法, 并详细介绍各方法的最新应用进展, 以期给糖类化合物分析提供新的思路。

　　关键词：糖类化合物; 分离; 鉴别; 进展;

Progress on Analysis Methods for Carbohydrates

　　Abstract：Carbohydrates have long been regarded as important components of biological structures and energy source. In recent years, carbohydrates, especially carbohydrates with multiple biological functions, have attracted widespread attention. The analysis methods for carbohydrates is an important area in carbohydrates research. The combination of a variety of separation and analysis techniques has become the development direction of the analysis methods for carbohydrates. This paper reviews the commonly used separation and detection methods for carbohydrates and introduces the new development and application of each method in detail, in order to provide new ideas for analysis of carbohydrates.

　　Keyword：carbohydrate; separation; identification; progress;

　　糖类是自然界分布广泛、数量最多的有机化合物, 是食品的主要组成成分之一。糖类不仅是生命活动的能源物质和结构材料, 还是重要的信息分子和应答调节剂, 有降血糖、调血脂、节约蛋白质消耗、提高免疫力、抗肿瘤等多种保健功能。同时也是主要的风味物质, 其种类和含量直接决定了产品的理化性质和感官品质。

　　早期的分析糖类化合物的方法有光度法、电泳法和容量分析法 (斐林试剂热滴定法、SHS碱性铜试剂滴定法) 等[1], 这些方法无专一性, 仅能测定一类糖。紫外和气相色谱法均为测定糖类的常用方法, 但均需衍生化后测定, 这给实际分析工作带来较大的不便与误差。多糖药物是目前国内外研究的热点之一, 甚至形成了一个新的学科——“多糖药物学”。随着高效液相色谱法、高效阴离子交换离子色谱法、高效毛细管色谱法在分析糖类化合物方面取得的进展, 特别是和质谱检测器的联用, 逐渐地替代传统检测方法[2]。因此本文综述了糖类分析常用的分离和检测方法, 并详细介绍各方法的最新应用进展, 以期给糖类化合物分析提供新的思路。

　　1 分析方法

　　1.1 气相色谱法 (GC) 、裂解气相色谱法 (PGC) 和气质联用法 (GC-MS)

　　GC测定糖类, 具有选择性好, 分辨率高、分析速度快, 样品用量少, 灵敏度高等特点。但GC对样品常具有一定的破坏性, 对样品要求易挥发且对热稳定, 所以糖类测定需要事先进行衍生。一些相对分子质量 (Mr) 较大的寡糖和多糖, 需事先经水解、Smith降解和甲基化等过程将其降解为结构简单的单糖后再进行衍生, 操作较复杂。RuizAceitun等[3]建立了一种将糖类化合物溶解在离子液体中后进行甲基化衍生气相色谱检测的方法, 提高了分析的灵敏度。

　　PGC[4]作为一种间接的研究方法, 已被广泛用于分析难挥发化合物 (包括聚合物) 。PGC和红外光谱 (IR) 联用、PGC和核磁共振波谱 (NMR) 联用以及PGC和质谱 (MS) 联用等, 已经成为鉴定糖类物质的重要手段, 可了解多糖样品中单糖的组成及其大致的分支情况。

　　GC-MS具有高分辨率和高灵敏度等特点, 可同时完成待测组分的分离和鉴定, 被广泛用于复杂糖类物质的定性定量分析[5]。Becker等[6]用甲硅烷基化样品后, 采用GC-MS分析了不同基质中的单糖和二糖。

　　1.2 高效毛细管电泳法 (HPCE)

　　近年, HPCE在单糖化合物、低聚糖以及多聚糖的分析中显示出巨大的优越性[7]。HPCE相比常用的高效液相色谱法 (HPLC) 在效率, 速度和成本等方面更具优势。

　　简单的单糖和寡糖一般是中性糖, 需将其转化成带电荷的形式进行电泳分离。一般选用强碱性的缓冲液 (p H>11) 或硼酸盐缓冲液使之带负电以进行电泳。多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后分离分析。

　　常用的HPCE检测糖的方式的有紫外检测 (UV) 、电化学检测 (ECD) 、激光诱导荧光检测 (LIF) 、MS等。UV法是主要检测手段, 但灵敏度低, 检出限在pmol范围。ECD的灵敏度比UV法高很多, 方法的检出限和线性范围令人满意, 但其重现性差, 且无商品化的检测器。LIF灵敏度最高, 检出限在10-18 mol以下;HPCE与MS联用是对糖类化合物定性、定量及结构分析的理想方法, 其特点是精密度高、快速, 所需样品少, 但两种方法仪器昂贵, 故应用不广泛。

　　Oliver等[8]比较了HPCE和HPLC测定植物纤维中的单糖, 发现HPCE可获得更好的分离度且无需复杂前处理。Wang等[9]建立了一种简便、快速测定包括己醛糖、五碳醛糖、麦芽糖和乳糖在内的13种还原糖的HPCE方法, 此法具有较高分离效能和高选择性。

　　HPCE对单糖、寡糖的分析趋于成熟, 对多糖及糖缀合物的分析分离也开始得到重视。HPCE与HPLC、亲和色谱 (AC) 、NMR、MS等技术联用可获得关于多糖及糖缀合物更完整的信息。

　　1.3 高效液相色谱法 (HPLC)

　　HPLC是目前糖类物质分析中最常用方法之一。测定糖类的主要的检测器是紫外检测器 (UV) 、荧光检测器 (FD) 、示差折光检测器 (RID) 和蒸发光散射检测器 (ELSD) 等, 应根据糖类的含量、纯度和种类等选择适合的检测器。HPLC的多种分离模式可满足大部分不同性质糖的分离分析[10]。

　　U V检测糖类必须经衍生化。部分糖类化合物在190~195 nm附近有紫外吸收, 可直接进行UV检测, 但流动相只能用水, 除非是相当干净的试样, 否则很难使用。RID作为HPLC的通用型检测器, 只要试样成分和流动相的折光率有差别即可检测, 在糖类物质分析中应用非常普遍。但灵敏度较紫外或者荧光检测低, 选择性较差, 易受温度和流动相的影响, 不能采用梯度洗脱进行多组分分析。ELSD对所有不挥发溶质均有高灵敏度, 不受溶剂成分及温度波动的影响, 亦可用于梯度洗脱, 适于分析糖类, 尤其低聚糖效果较好。近年, 应用领域主要有烟草、中药材及提取物、食品及饮料以及含单糖成分特别是葡萄糖的化学药制剂中单糖的含量测定。此外, 在杂质分析、尿液及药物合成过程控制中测定单糖也有报道[11]。《中国药典》2005年版首次在液相色谱法项下收载了ELSD。FD在灵敏度和检测选择性方面均很优越, 但需通过柱前或柱后荧光衍生法使其具有荧光性, 此法可大大提高检测的灵敏度, Zhang等[12]用HPLC-FD柱前衍生测定了宽叶羌活中的糖类化合物, 取得了较好的灵敏度。

　　糖专用分析柱对糖类物质具有较好分离效果, 但通常价格昂贵。氨基键合固定相是糖专用分析柱中较常用的一种固定相, 有较高的分离效率, 但由于自身的水解缩短了其使用寿命。在使用ELSD和MS检测器时, 此问题更为明显。此外, 如不使用升高柱温, 许多氨基键合相柱对一些还原糖还会形成很差的峰形并产生双峰[13]。普通硅胶柱或C18柱分离糖类时, 在流动相中加入有机胺作为改性剂对其进行动态修饰, 可得到与化学键合氨基柱柱效相当的动态修饰柱, 且由于柱上吸附的有机胺不断更新, 分析柱可长时间保持稳定。亲水作用色谱 (HILIC) 是一种以极性固定相 (如硅胶或衍生硅胶) 及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的色谱模式。HILIC较多用于检测单糖、二糖和低聚糖。Karlsson等[14]用HILIC-ELSD分离测定了葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、D-葡糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺。

　　1.4 液相色谱-质谱联用法 (LC-MS)

　　与其他液相检测器相比, MS检测器有较多优越性。首先, 有更高的灵敏度。大多数情况下, 质谱检测所需样品量只是纳克甚至皮克;其次, 有普遍性。在合适的电离方法下, 一般化合物均能被电离被质谱检测;再次, 利用串联质谱检测方法, 可获得更多化合物结构方面的信息, 且对样品纯度要求较低, 减少了分析时间和工作量。LC-MS可提供保留时间及所对应的质谱图, 提供Mr和大量碎片结构信息, 能分离不同质荷比的色谱峰。另外MS是一种通用型的检测器, 也可用于分析对热不稳定的物质。因此, LC-MS联用在糖类检测中有极其重要的意义。

　　Harrison等[15]用石墨化碳柱色谱 (GCC) 分离-线性离子阱质谱联用检测的手段研究了以13C标记的蔗糖和蔗果三糖 (1-kestose) 为底物, 分别用重组果糖基转移酶6G-FFT (fructan:fructan 6G-fructosyltransferase) 和6-SFT (sucrose:fructan 6-fructosyltransferase) 催化合成的β (2→1) (inulins) 和β (2→6) (levans) 果聚糖的二级与三级质谱碎裂模式, 建立了分离和鉴定果聚糖异构体的液相色谱-质谱 (LC-MSn) 方法。以上工作对于其他含有不同糖苷键的同多糖或寡糖的结构分析、构效关系研究及寡糖转化酶的菌种筛选检测具有一定的借鉴意义。

　　Leijdekkers等[16]使用亲水作用色谱 (HILIC, 用UPLC BEH amide柱) 研究建立了能同时分离测定甜菜果胶、黄蓍胶及甜菜渣等植物细胞壁提取物的酶解产物中不同聚合度、部分甲酯化或同时乙酰化的各种中性和酸性杂寡糖混合组分, 并表征其组成结构的超高效液相色谱-蒸发光散射检测-质谱 (UPLC-ELSD-MSn) 分析方法。将各酸性寡糖组分的保留行为与其质谱数据相结合, 可对其复杂的混合物样品进行有效的寡糖组成和序列结构分析。

　　1.5 高效阴离子交换色谱法 (HPAEC)

　　近年, 高效阴离子交换色谱-脉冲安培法 (HPAEC-PAD) [17]可用于分析各种食品中的单糖、低聚糖、多糖、糖醇、糖胺、糖醛酸以及其他糖类衍生物。HPAEC-PAD是在强碱性介质中, 用高效阴离子交换柱分离糖类, 然后检测糖分子结构中的羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电流[18]。HPAEC检测糖主要使用金电极的脉冲安培检测器, 可检测pmol/L的糖, 而且不需衍生反应和复杂的样品纯化处理。另外, 直流安培检测器不能用于检测糖, 主要是因为糖氧化产物对电极产生不可逆的污染[19]。

　　Cordella等[20]建立了一套判别蜂蜜糖浆掺假甚至以淀粉糖浆喂养蜜蜂得到的蜂蜜掺假的方法, 利用HPAEC-PAD检测样品中蔗糖和麦芽糖的增减情况, 并通过线性判别分析和偏最小二乘法统计, 最终判别未知样品的掺假情况。Haska等[21]研究了不同品种和产地的小麦粉中的果聚糖情况, 通过HPAEC-PAD确定样品中果聚糖的Mr分布。对于聚合度更高的多糖, 可通过适当的酶水解或酸水解手段将多糖分解为单体结构后再检测。

　　HPAEC-PAD法与传统的糖类色谱法相比较有以下的优点: (1) 灵敏度高, 可达pmol水平; (2) 分析时间短, 一般在15~30 min内即可完成; (3) 无需进行衍生化和严格的样品处理; (4) 可用梯度洗脱; (5) 色谱柱的选择性及分辨率高; (6) 柱及检测器的使用寿命长。HPAEC-PAD法检测糖成分时因为灵敏度高而不会丢失低含量糖组分的信息, 研究低聚糖和多糖组成时信息更为全面。这种方法也有其不足之处, 如某些不稳定的基团在较强碱性条件下可能发生降解;柱的容量小, 不适于制备性分离;不同的寡糖有不同的响应因子。所以在定量的准确性和方便性上不如荧光法 (如氨基吡啶衍生化法) 。

　　分析食品中的低聚糖, 植、动物和真菌多糖的Mr分布和结构研究近期还将是发展重点, 而这些研究很可能会进一步借助HPAEC与MS的联用技术, 更好地对这些糖进行定性和定量。Kotnik等[22]用HPAEC-PAD和MS测定了动物血浆中的糖类成分, 作为无创式的诊断手段。分析更复杂基体样品如食品和环境样品等及生化样品中结构及性质相似的糖等, 将是此法未来研究的重点。

　　1.6 凝胶色谱法 (GPC)

　　GPC主要用于分析大分子多糖, 其分子筛的作用使不同Mr的多糖以不同淋出体积被淋出柱外, 淋出体积和Mr间有一定的关系, 因此可通过淋出体积得出相应的Mr。此法可用于测定多糖的Mr和纯度。凝胶色谱还可用于制备性的分离多糖, 为其结构分析做准备。

　　G P C测定多糖Mr所用柱填料为刚性或半刚性水溶性凝胶, 常用的凝胶填料中效果较好的是Lonpak系, Macrosphere系和TSK系柱, 前两者用水作洗脱剂, 后者采用缓冲溶液如磷酸盐缓冲液作洗脱剂。通常一次分析在30min内完成[23]。GPC测Mr有许多局限性, 目前已有用激光光散仪作为测Mr用的附加检测器, 不需标准品校准, 克服了样品与标准品的化学组成、分子结构及大小不同带来的误差。

　　1.7 质谱法 (MS)

　　MS用于糖类的研究具有重现性好, 灵敏度高等特点, 能测定某些糖的Mr, 对一些结构较简单的糖还可提供结构信息、确定糖的链接方式[24]等。1991年MOCK等首次用基质附助激光解吸电离法 (MALDI) 测定碳水化合物, 近十年的研究表明, 其最突出的优越性在于能测定不经衍生化的天然糖类物质[25]。糖类化合物如中性糖、酸性糖、硫酸化糖、糖蛋白、蛋白聚糖及糖脂等均可利用适合的基质进行基质附助激光解吸电离-飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 分析[26]。

　　邓慧敏等[27]用MALDI-TOF-MS法测定从动植物体中提取的环状和线状寡糖及葡聚糖, 结果表明, 天然糖类质谱图有鲜明可辨的特征。张云峰等[28]综述了生物质谱在糖药物学分析中的应用, 文中提到一些新的离子化技术, 如 (电喷雾电离) (ESI) 和MALDI, 可以克服快原子轰击质谱法 (FAB-MS) 中等灵敏度和大多需衍生化的缺点, 特别是与MS联用时能修复碎片, 多级质谱可直接检测混合物并能提供清晰的分子离子与碎片离子之间的关系。随着完整的谱图库的建立, 生物质谱结合NMR将成为糖类化合物分析中有力的工具, 能更深入地阐明糖的结构及其构效关系, 对正在发展的糖药物学和糖基化工程起到巨大的推动作用。

　　1.8 核磁共振法 (NMR)

　　NMR技术的发展和高磁场NMR仪的出现, 在糖类结构的光谱解析中逐渐起着决定性的作用。尤其80年代发展起来的2D-NMR[29]技术, 可使多糖的1H-NMR和13C-NMR谱得到归属, 并使确定多糖的全结构成为可能。另一方面, 多糖分子的结构特点使其NMR谱有小的线宽, 因此能得到分辨率比蛋白质分子好的谱图[30]。

　　对于复杂的糖类, NMR可在有或没有背景知识的情况下获得糖类化合物最完全的结构信息及其在溶液中或固态的行为。同时应用NMR技术还可通过计算机将样品的1H-NMR和13C-NMR谱数据与数据库信息比较, 确定糖类化合物的结构。当然, 对于一个全新的多糖结构研究, NMR通常还需与其他方法联合使用。此外, NMR实验中所用的样品可很容易地通过除去溶剂回收。

　　NMR技术已经成为糖类化合物结构、构象研究必不可少的研究手段之一。同时, 新的脉冲序列的涌现、脉冲梯度场的应用、探头和磁场等硬件的不断升级及计算机分析软件的应用都为NMR技术在糖类化合物的研究中提供了广阔的前景[31]。此外, 随着糖类化合物中13C标记技术的不断成熟和完善, 糖类化合物有望同蛋白质一样, 大量使用3D、4D实验方法, 更好地研究糖类化合物的结构[32]。NMR技术在定量方面也有发展, Souza等[33]采用NMR技术建立了一种定量测定多糖的方法, 实验通过两步水解的方法优化纤维素和半纤维素的最优NMR条件, 然后应用于多糖测定。

　　1.9 圆二色谱法 (CD)

　　圆二色谱图已成为糖类、多肽、蛋白质、核酸等化合物结构分析中的一种常规手段。与蛋白质相比, 糖类化合物的CD具有不同的特点[34]: (1) 生色基的种类、空间取向及连接方式的多样性决定了糖类化合物结构的复杂性, 使CD的数据处理更繁琐; (2) 多糖的空间构象复杂, 但从糖类化合物CD的形状和强度, 仍可了解寡糖 (或多糖) 的一级结构和空间构象等方面的结构信息, 甚至可作为糖类化合物结构变化的一种检测手段。

　　碳水化合物的结构决定CD的强度和形状, 而从CD获得的构象信息的多少取决于样品结构的复杂程度;对于具有较好重复系列的糖类化合物, CD能提供更可靠的空间结构信息。对于结构较复杂的糖类, 即使不能直接测定糖类化合物的绝对构象, 利用一些经验规则仍可进行推断。此外, 糖类化合物的CD数据库远未完善, 限制了CD在糖类结构研究中的应用。但CD作为一种光谱学方法, 通过结合NMR、X-射线衍射及分子模拟等方法, 在深入了解糖类化合物的空间结构方面有巨大潜力。

　　2 展望

　　目前, 测定糖类的方法很多, 常用的方法有GC、GC-MS法、HPLC、HPAEC等。HPAEC-PAD法检测灵敏度高, 但由于安培检测的稳定性差, 人们仍在探寻新的电极材料。GC-MS技术测定糖类, 不仅有选择性好、样品用量少、分辨率高等优点, 更主要的是利用质谱裂解碎片可推断该化合的基本结构。但是利用该方法, 需提高要分析的有机化合物的热稳定性和挥发性, 这对于提高GC高效分离该有机物的能力和MS鉴定该物质的高灵敏度都是极为重要的。MS普遍采用有机化合物电离方法, 由于该方法可能缺乏相应的结构信息, 使得某些有机化合物的结构无法得到解释。且MS的质量检测上限相对较低 (未超过10×103) 。

　　随着新的MS技术不断涌现, 上述所遇到的问题正在得到逐步的解决。新的电离技术如场电离, 场解吸, 快原子轰击, 基质辅助激光解析电离, 热喷雾离子化, 电喷雾离子化等的形成和发展使得一些热不稳定的, 极性较高的, 不易挥发的化合物, 甚至是生物多聚体均可用于质谱鉴定。但是这些方法未给出化合物足够的结构信息。串联质谱以及傅立叶转换质谱的发展, 使质谱具备了超高质量分辨率。通过使用时间飞行检测器, 有机物的质量检测范围也扩展到了500×103, 甚至更高。然而, 所有的这些先进技术的使用也不能完全解决特殊化合物在质谱结构测定方面的缺陷。另外一种相当简便且能有效克服上述困难的方法是对有机化合物进行仪器分析前的化学衍生化。适当的化学衍生化不仅有助于改进有机物的物理化学性质, 而且可改善色谱峰形和提高对结构相似化合物的分辨率。相信随着分离技术的发展, 以及多种检测技术的联用, 糖类化合物在分离和结构鉴定发面会得到更大的进展。

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第二篇：乳粉中糖类的色谱及质谱检测方法研究进展

作者：李莉 薛伟锋 曹文军

单位：大连市检验检测认证技术服务中心 大窑湾海关技术中心 中检(大连)测试技术有限公司

　　摘要：本文总结了乳粉中糖类化合物的色谱及质谱检测方法，包括气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法和液相色谱-质谱法，分析这些方法的优缺点。目前，离子色谱法已成为乳粉中糖类检测的最常用方法，而高分辨质谱在灵敏度和抗干扰能力方面表现出优势，成为未来乳粉中糖类检测方法的重要发展趋势。

　　关键词：乳粉; 糖类化合物; 色谱; 质谱; 研究进展;

Recent Progress in the Application of Chromatography and Mass Spectrometry for the Detection of Carbohydrates in Milk Powder

　　Abstract：This paper reviews the progress in the application of gas and liquid chromatographies, ion chromatography and liquid chromatography-mass spectrometry for the detection of carbohydrates in milk powder. It points out the advantages and disadvantages of these methods. While ion chromatography is nowadays the most used technique to detect carbohydrates in milk powder, ion chromatography will be an important trend in this field owing to its distinct advantages in terms of sensitivity and anti-interference ability.

　　Keyword：milk powder; carbohydrates; chromatography; mass spectrometry; progress;

　　糖类作为乳粉中一类重要的营养成分，对人体起着至关重要的作用，如乳糖经乳糖酶作用后转化为有机酸，能够有效促进钙离子的吸收。另外，肠道健康也得益于乳糖对有益菌生长的促进作用。但有时乳糖也会起到反作用，如乳糖对某些体内缺乏乳糖酶的乳糖不耐受者危害很大，由于乳糖消化吸收功能受阻，乳糖不耐受者可能出现腹泻和腹痛等症状[1]。蔗糖虽然可以提高乳粉含糖量，但过量食用则会导致蛀牙和肥胖等。功能性低聚糖在婴幼儿乳粉中作用显著，不仅能促进婴幼儿肠道有益菌群繁殖，还能增强免疫力，提高肠道防御功能，预防感染性腹泻，改善功能性便秘[2,3,4,5,6,7]。国家标准也对婴幼儿食品中功能性糖类物质的添加量进行了规定，如GB 14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》[8]规定，作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中的功能性糖类物质总含量不得超过64.5 g/kg。尽管添加低聚糖的婴幼儿配方乳粉是乳粉行业的一大亮点，但也存在低聚糖添加量极少的尖锐问题。因此，建立乳粉中糖类的检测方法至关重要，掌握乳粉中糖含量对于了解乳粉品质和指导消费者具有重要意义。

　　目前，糖类的分析方法主要有酶解法[9]、气相色谱（gas chromatography,GC）法、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）法[10,11]、高效液相色谱（high performance liquid c h r o m a t o g r a p h y,H P L C）法[12,13]、离子色谱（ion chromatography,IC）法[14,15,16]和液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS）法等[17,18,19]。色谱及质谱分析方法已经成为糖类检测的最主要手段，本文在总结已有研究的基础上，结合近年研究动态，综述乳粉中糖类检测的色谱及质谱分析方法研究进展，方便科研人员选择合适的糖类检测方法。

　　婴幼儿乳粉基质复杂，所含糖种类多且含量差异大，因此对分离条件要求较高。尽管GC和GC-MS法对糖类的分析灵敏度较高且分离效果好，但存在样品前处理步骤复杂的问题，尤其是对某些分析物需进行衍生化反应。HPLC法受到检测器的影响，对糖类的分析灵敏度相对较低。结合优化的梯度洗脱程序的IC-电化学检测法[20,21]在糖类分析中表现出分离效果好、灵敏度高和选择性强等特点[22,23]，已被美国分析化学家协会等机构广泛应用于食品分析检测中[24]。针对复杂的乳粉样品基质，高分辨质谱在灵敏度和抗干扰能力方面表现出优势，成为未来乳粉中糖类检测方法的重要发展趋势[17,18,19]。本文针对上述几种方法重点阐述乳粉中糖类检测方法的研究进展。

　　1 GC法

　　孙曼泽等[25]采用GC法测定乳粉中的乳糖和蔗糖，测定乳糖的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为4.52%，回收率为94%～104%，测定蔗糖的RSD为4.35%，回收率为97.7%～102.3%；另外，根据GB 5413—1985《乳粉检验方法》[26]中的方法测得乳粉中的乳糖含量为30.5%，蔗糖含量为19.6%,2种方法的相对误差分别为0.66%和1.50%，表明用GC法测定乳粉中的乳糖和蔗糖操作简便、分析速度快、准确度高，可以作为乳粉中乳糖和蔗糖含量的测定方法。但GC法需要对样品进行衍生化反应，反应条件较为苛刻。Block等[27]采用GC法测定11批脱脂牛乳中异构化乳糖的含量，结果表明，GC法对于脱脂乳中异构化乳糖的检测限为50 mg/L。Montilla等[28]利用对位取代苯酚氧苷作为内标，建立乳制品中异构化乳糖含量的GC测定法，并采用该方法检测27份商业牛乳样品，回收率为89.6%～110.6%。

　　2 HPLC法

　　HPLC是糖类检测的重要手段，在对样品进行前处理后，选取不同的色谱柱和流动相，通过示差折光检测器或蒸发光散射检测器对糖类进行分析。例如，黄红霞[29]应用HPLC对乳粉及调制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖进行测定，将样品经简单的前处理后由碳水化合物分析柱分离，以乙腈/水为流动相，采用示差折光检测器进行检测，结果表明，乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖能够完全分离，回收率为100.4%～106.1%,RSD<0.9%，线性相关系数（R2）在0.998 3以上，证明该方法能够简便、快速测定乳粉及调制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖。吴莉等[30]使用HPLC对乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖进行测定时发现，样品经简单的预处理后，采用Spherisorb NH2色谱柱（0.46 cm×25 cm,7μm）分离，以乙腈/水（体积比7∶3）为流动相，流速1 mL/min，采用示差折光检测器检测，3种糖类能够完全分离并定量，R2达0.999，回收率为99.98%～105.10%,RSD<0.6%，证明采用HPLC法能够对乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖进行快速、准确测定，方法简单易行。郭秀春等[31]选用市售同种品牌不同年龄段的乳粉，通过HPLC-示差折光检测器法对其乳糖和蔗糖含量进行测定，结果表明，蔗糖和乳糖的线性范围均为2～12 mg/mL,R2分别为0.999 3和0.999 6,RSD分别为2.53%和3.81%，平均加样回收率分别为99.70%和101.06%，该方法测定结果准确、分析时间短、前处理简单，适用于快速测定乳粉中的蔗糖和乳糖含量。Wang Xinmin等[32]建立了一种HPLC-示差折光检测器分析配方乳粉中氨基葡萄糖和乳糖的简单方法，样品在进行HPLC分析前经过蛋白质沉淀净化，采用昭和电工Asahipak NH2P-50柱（4.6 mm×250 mm,5μm）分离，流动相为乙腈-水（体积比7∶3），结果表明，该方法具有很好的线性（R2均大于0.99）、灵敏度（检出限分别为0.11、0.13 mg/mL，定量限分别为0.21、0.23 mg/mL）、精密度（RSD分别为1.26%和1.06%）和回收率（分别为96.5%～98.2%和97.1%～98.0%），整个分离过程在10 min内即可完成，该方法可以达到快速、简便检测乳粉中糖类的目的。

　　那红萍等[33]采用HPLC法，以资生堂UG80S5柱（4.6 mm×250 mm,5μm）为分析柱，示差折光检测器检测，1次进样同时测定乳粉低聚果糖中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，结果表明，3种糖的回收率为98.8%～105.9%,RSD为0.20%～0.26%，最低检出限为微克级。陈小英等[34]采用HPLC法同时测定乳粉中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，采用Agilent NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm），流动相为乙腈-水（体积比7∶3），示差折光检测器检测，结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖质量浓度分别在0.305 0～6.100 0、0.405 4～8.108 0、0.245 7～4.914 0 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，R2均在0.999 5以上，3种物质的加样回收率平均值分别为96.1%、100.3%和100.0%,RSD分别为1.5%、2.9%和3.3%，该方法简便、准确、可靠，适用于乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖3种主要有效成分的测定。许彬等[35]采用HPLC法检测乳粉中的低聚果糖，样品经硫酸铜（质量浓度100 g/L）和氢氧化钠（质量浓度40 g/L）去除蛋白后，采用氨基色谱柱分离，示差折光检测器分析，柱温30℃，流速1 mL/min，流动相为乙腈/水（体积比7∶3），外标法定量，结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在一定质量浓度范围内线性关系良好，添加回收率分别为99.1%、99.7%和95.3%,RSD分别为0.3%、1.1%和0.3%，检出限分别为2、2、4 mg/kg，该方法快速灵敏、简便、准确，适用于乳粉中低聚果糖的检测。

　　Chávez-Serv?n等[36]建立一种HPLC-示差折光检测器定性和定量分析配方乳粉中游离单糖和二糖（包括果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳果糖和乳糖）的简单方法，结果表明，该方法具有很好的线性拟合系数（R2>0.99),6种糖的检测限分别为0.17、0.13、0.06、0.16、0.05、0.25 mg/mL，定量限分别为0.27、0.24、0.20、0.26、0.22、0.38 mg/mL，果糖、蔗糖、乳果糖和乳糖的RSD分别为0.78%、0.99%、2.91%和0.46%,6种糖的回收率为93%～113%。

　　除了HPLC-示差折光检测器外，HPLC-蒸发光散射检测器也常用于乳粉中糖类的检测。例如，赵敏等[37]建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的HPLC-蒸发光散射检测器联用技术，采用氨基柱分离，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，结果表明，6种功能性低聚糖得到很好分离，回收率为91.8%～102.0%,RSD<3%(n=6），该方法能快速、准确、可靠地检测婴幼儿配方乳粉中功能性低聚糖的含量。孙久玉等[38]使用蒸发光散射检测器测定配方乳粉中低聚果糖的含量，样品用体积分数75%乙醇水溶液提取，通过旋转蒸发将溶剂置换成50%乙腈水溶液，并通过C18固相萃取柱除去样品中多余的脂肪类物质，进一步净化样品，采用Waters UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.7μm），流动相采用乙腈和水，进行梯度洗脱，结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的检出限均为20 mg/100 g，回收率在88.5%以上，RSD均小于1.5%，完全能够满足配方乳粉中低聚果糖的检测要求。

　　3 IC法

　　采用IC法测定糖类已有较多报道，如测定蜂蜜和葡萄酒[39]、蜂蜜和蜂胶[40]以及茶叶[41]中的糖等。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法[42,43,44]是近年来发展起来的一种测定糖类的有效方法，该方法具有前处理简单、分离效果好和操作简便等优点[45]，已被用于牛乳和乳制品中单糖和二糖的测定[46]。利用IC法同时测定乳粉中的多种糖类已经成为一种趋势。

　　张水锋等[47]建立梯度洗脱-IC-脉冲安培检测技术，分析婴幼儿配方乳粉中半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖5种与代谢疾病紧密相关的糖类。该方法对样品的前处理、色谱柱、淋洗液梯度等色谱条件进行优化，重点研究淋洗液梯度对各组分分离效果的影响；将梯度洗脱程序分解为弱保留组分分离、乳糖分离、基质消除、系统平衡4个子程序，并分别对其进行条件优化，实现了5种组分的完全分离，并有效解决了弱保留组分色谱峰易重叠、乳糖色谱峰易拖尾等现象；5种组分的线性范围为0.5～100.0 mg/L,R2>0.9 9，方法检出限为0.0 6～0.4 0 m g/L；该方法具有分离度好、灵敏度高等优点，可满足例行分析的要求，同时也为淋洗液的梯度优化提供了可借鉴的方法。熊建飞等[48]建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定乳粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法，以METROSEP CARB1阴离子交换柱（4.0 m m×1 5 0 m m,5μm）为分离柱，37 mmol/L氢氧化钠溶液为淋洗液，以柠檬酸作为蛋白质沉淀剂，结果表明，葡萄糖、蔗糖和乳糖的线性范围分别为1～40、1～50、1～50 mg/L,R2分别为0.996 6、0.996 8和0.998 5，检出限分别为0.014、0.091、0.083 mg/L,RSD为1.10%～4.96%，回收率为90.13%～104.83%，该方法分析时间短、前处理简单，适用于快速测定乳粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖。

　　冉丹等[49]建立以电化学脉冲安培-IC法检测婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide,GOS）含量的方法。首先采用IC法检测经β-半乳糖苷酶酶解的原料糖浆试样中GOS含量，再以测得GOS含量的同批次原料糖浆作为对照，检测婴幼儿配方乳粉中GOS含量。通过对仪器色谱条件及前处理方法进行比较优化，发现该方法线性关系良好，R2为0.999 7,RSD为3.5%，加标回收率为87.7%～92.4%。张志国等[50]建立指纹图谱法测定婴幼儿配方乳粉中GOS含量的方法，利用IC构建GOS指纹图谱，分析得到特征组分，进而测定婴幼儿配方乳粉中GOS含量，结果表明，当称样量为1.0 g时，GOS检出限为2.5 g/kg，定量限为5.0 g/kg，线性范围为4.0～64.5 g/kg，回收率为94.0%～106.7%,RSD为1.2%～2.8%，表明指纹图谱法的准确度和精密度满足婴幼儿配方乳粉中GOS含量测定的需要。

　　朱伟等[51]建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的高效离子色谱检测技术，采用CarboPac PA20色谱柱（3.0 mm×150 mm,6.5μm）分离，以氢氧化钠-乙酸钠为流动相，进行梯度洗脱，使用脉冲安培检测器进行检测。结果表明，8种功能性低聚糖得到很好分离，回收率为80.0%～103.0%,RSD<3%(n=6）。该方法能快速、准确、可靠地检测婴幼儿配方乳粉中功能性低聚糖的含量。

　　Cataldi等[46]建立一种简单、灵敏的用于分离和定量乳粉中单糖和二糖的液相色谱方法，经净化和适当稀释后测定样品中乳糖、半乳糖、葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖含量，分离过程在高效阴离子交换色谱仪（配备脉冲电流检测器）中完成，以金作为电极，乙酸钡的碱溶液（含10 mmol/L氢氧化钠和1 mmol/L乙酸钡）作为流动相，根据样品的不同，考虑最佳分离效果选取洗脱液，确保没有基质效应影响。结果表明，该方法具有良好的灵敏度和准确度，可以用于牛乳、干酪等乳制品中单糖和二糖的检测。

　　4 LC-MS法

　　除了GC、GC-MS、HPLC和IC外，液相色谱-质谱法也被用来分析乳粉中糖类。刘芸等[17]建立高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定乳粉中低聚果糖的方法，采用碳水化合物分析柱（2.1 mm×100 mm,2.6μm）进行分离，以乙腈与0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，质谱采用正离子模式，结果表明，该方法对蔗果三糖和蔗果四糖的检出限可达100μg/kg，对蔗果五糖的检出限可达55μg/kg，加标回收实验结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的平均回收率为75.8%～107.3%,RSD为1.6%～8.3%。甄振鹏等[18]建立乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的HPLC-MS/MS检测方法，采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm,3.5μm），以乙腈-氨水溶液为流动相进行洗脱，选择电喷雾质谱负离子源，在多反应监测模式下进行测定，结果表明，该方法对蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的检出限分别为0.032、0.022、0.039、0.054 mg/kg，回收率为90.8%～95.8%,RSD为3.6%～9.0%(n=6）。甄振鹏等[19]还建立了测定乳粉中棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的HPLC-MS/MS方法，同样采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm,3.5μm），以乙腈-水溶液为流动相进行洗脱，选择电喷雾离子源负离子模式，在多反应监测模式下进行测定，结果表明，该方法对棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的检出限分别为13.4、7.7、11.1μg/kg，回收率为80.8%～86.6%,RSD为3.0%～8.0%(n=6）。

　　5 结语

　　对于没有紫外吸收的低聚糖类，通常采用HPLC-示差折光检测器法、HPLC-蒸发光散射检测器法和IC法测定。示差折光检测器法存在系统平衡时间长、分析过程需要恒温且无法梯度洗脱的问题，另外，该方法检测灵敏度低，对于低聚果糖含量0.5%～2.0%的添加益生元的食品非常不适用。HPLC-蒸发光散射检测器法和IC法克服了示差折光检测器方法的不足，虽然灵敏度有所提高，但对于含有单糖和双糖的乳粉中低聚果糖的测定效果很差，从而影响了低聚果糖的准确定量。为了能够良好分离简单基质样品中的低聚果糖，需要花费分析时间。IC法和蒸发光散射检测器法在分析复杂基质样品时存在前处理过程复杂和定量结果偏差大等不足。对于以上问题，考虑到乳粉样品基质较复杂，充分利用高分辨质谱在灵敏度和抗干扰能力方面的优势，建立前处理过程简便、分析时间短、测定结果准确的方法成为未来乳粉中糖类检测的重要发展趋势。

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