第三章 DNA 的优化
3.1 试验材料与方法
3.1.1 试验材料和药品
3.1.1.1 试验材料
试验材料同 2.1.1.1。
3.1.1.2 试剂
CTAB、5mol/L NaCl、氯仿：异戊醇（24:1）、无水乙醇、异丙醇、TE 缓冲液、蒸馏水、液氮、Golden view(艾德莱生物试剂有限公司)、Loading Buffer(天根生物试剂有限公司)、Marker DL2000（天根生物试剂有限公司）、PVP、β-巯基乙醇、RnaseA(10mg/mL).
3.1.2 试验方法
对 CTAB 法进行改良，优化提取的 DNA，主要从以下几方面改良：
3.1.2.1 多酚类物质的去除
在加入 CTAB 提取液时迅速加入 14?l β-巯基乙醇，进行水浴加热，观察现象，拍照得到图 3-1，提取 DNA 之后进行电泳检测得到电泳图，见图 3-2。
3.1.2.2 多糖等的去除
卡特兰叶片多汁，含糖量较高，紫外吸收值检测也显示含有糖类盐类等小分子。对于多糖等小分子杂质的去除，前人的研究主要有加入 PVP 去多糖法和无水乙醇沉淀阶段加入 NaCl 溶液去多糖法。所以本次主要设置以下几组试验：（1）只在 CTAB 溶液中加入2g PVP，沉淀阶段方法无变化，同 2.1.2。（2）提取液中不加 PVP，在无水乙醇沉淀 DNA阶段，加入 0.5 倍体积的 5mol/L NaCl 溶液，混匀后，再加入预冷的无水乙醇。（3）既在提取缓冲液中加入 PVP，又在无水乙醇沉淀之前加入 0.5 倍体积的 5mol/L NaCl 溶液。（4）用异丙醇代替无水乙醇沉淀 DNA。试验结果见图 3-3 和图 3-4。
3.1.2.3 蛋白的去除
对于蛋白的去除主要是采用氯仿异戊醇抽提次数增加的方式，进行两次抽提。设置两组试验，一组为用氯仿异戊醇抽提一次，另一组为用氯仿异戊醇抽提两次，将提取的DNA 溶于 TE，进行电泳检测，拍照，得到图 3-5。
3.1.2.4RNA 的去除
卡特兰 RNA 污染严重，对于 RNA 的去除采用加入 RnaseA 的方法，设计试验，在上述方法提取出来的 DNA 中分别加入 0.1?l，0.2?l，0.3?l，0.4?l，0.5?l 的 RnaseA， 37℃水浴 30min，对 DNA 进行电泳检测，试验后将胶放在紫外透射仪下拍照得到图 3-6。
3.2 优化结果与分析
3.2.1 多酚类物质的去除
从图 3-1a 和图 3-1b 可以看出，取自同一材料同一部位的样品，研磨后未加入 β-巯基乙醇的 CTAB 溶液在水浴 20min 时明显变褐色，水浴 40min 结束时褐化更明显，而加入β-巯基乙醇的溶液还保持着绿色，说明 β-巯基乙醇能够在卡特兰 DNA 提取过程中起到防止褐化的作用。从图 3-1c 可以看出在 DNA 沉淀后用酒精清洗时，加入 β-巯基乙醇的实验组 DNA 为白色，而未加入 β-巯基乙醇的为浑浊的黄色，且用 70%酒精清洗 3 次后黄色仍为褪去。（见图 3-1）观察 DNA 的电泳结果，M 为 Marker DL2000，YY1,YY2,YY3 为对照组，即未加入β-巯基乙醇的实验组，YB1,YB2,YB3 为加入 β-巯基乙醇的实验组。从电泳结果可以看出，未加入 β-巯基乙醇依旧能够提取出来 DNA。（见图 3-2）在 ODA260/OD280 值上可以看出，未加入 β-巯基乙醇组的 DNAOD260/OD280 在 1.6左右，污染严重，加入 β-巯基乙醇组的 DNAOD260/OD280 值明显上升，接近 2.0。观察DNA 含量发现，未加入 β-巯基乙醇组的样品提取出来 DNA 含量最高为 400.1ng/?l，平均值为327.5±22.45 ng/?l，而加入β-巯基乙醇组的样品提取出来DNA最少为467.8 ng/?l，平均值为 489.8±20.11ng/?l，表明加入 β-巯基乙醇能够明显提高 DNA 的提取量。即加入β-巯基乙醇不仅能够提高 DNA 质量，减少多酚杂质污染，还能够提高 DNA 含量。（见表3-1）
3.2.2 多糖和盐离子的去除
从图 3-3a 和图 3-3b 可以看出，不同的沉淀方法对 DNA 影响效果较大。1 号加入无水乙醇后能够看到少许絮状沉淀， 2 号加入异丙醇后也出现少许絮状沉淀（见图 3-3a）。
图 3-3b 为在实验开始阶段加入了 PVP，沉淀时用无水乙醇沉淀，絮状沉淀十分明显。3号试管在上清液中加入 NaCl 溶液后未见变化，混匀后加入 2 倍体积无水乙醇迅速出现白色粉末状沉淀，且在冰箱中放置片刻后沉淀越来越多（见图 3-3a），用 70%酒精清洗三次仍为图 3-3c 所示，白色颗粒物虽然有所减少，但是量仍旧很多。说明前人提到的在无水乙醇沉淀步骤时加入 NaCl 溶液的方法并不适用于卡特兰，而无水乙醇沉淀的方法和异戊醇沉淀的效果从表象上相似，沉淀效果一般，实验中加入 PVP 然后用无水乙醇沉淀的DNA 得到的絮状沉淀最多最明显。（见图 3-3）
图中 P1,P2,P3 为加入 PVP 用无水乙醇沉淀的实验组。C1,C2,C3 为用 NaCl 溶液和无水乙醇沉淀的实验组。B1,B2,B3 为加入 PVP 并且用 NaCl 和无水乙醇沉淀的实验组。
T1,T2,T3 为原始的用无水乙醇沉淀的实验组。Y1,Y2,Y3 为用异丙醇沉淀的实验组。M 为Marker DL2000（见图 3-4）。从电泳图可以发现 C1,C2,C3 和 B1,B2,B3 样本条带拖尾明显，且 DNA 条带发生变形，说明杂质污染严重。P1,P2,P3 样本、T1,T2,T3 样本和 Y1,Y2,Y3样本 DNA 条带较清晰，其中 P1,P2,P3 样本 DNA 最清楚，且拖尾最少。
表 3-2 中，P1,P2,P3 为加入 PVP 用无水乙醇沉淀的实验组。T1,T2,T3 为原始的用无水乙醇沉淀的实验组。C1,C2,C3 为用 NaCl 溶液和无水乙醇沉淀的实验组。B1,B2,B3 为加入 PVP 且用 NaCl 和无水乙醇沉淀的实验组。。Y1,Y2,Y3 为用异丙醇沉淀的实验组（见表 3-2）。数据显示加入 PVP 且用无水乙醇沉淀的 DNA OD260/OD230 值在 2.0 附近，并且大部分大于 2.0，效果最好，DNA 的含量最高，平均值为 427.2±18.75ng/?l，略高于仅用无水乙醇沉淀的 DNA，无水乙醇沉淀和异戊醇沉淀得到 DNA 质量相近，OD260/OD230 值在 1.74～1.91 之间，含量差异不显着，DNA 含量均值分别为 392.8±9.95ng/?l 和 329.6±32.90ng/?l。在实验中加入 NaCl 溶液效果较差，C1,C2,C3，B1,B2,B3 的DNA 含量均值分别为 169.4±14.99ng/?l 和 125.0±11.70ng/?l。OD260/OD230 值均小于1.3，说明杂质污染严重，表明在溶液中加入 NaCl 的方法不适合卡特兰 DNA 的提取（见表 3-2）。
3.2.3 蛋白的去除
图 3-5a 为用氯仿异戊醇抽提一次得到的 DNA 进行的电泳，图 3-5b 为用氯仿异戊醇抽提两次得到的 DNA 的电泳图。M 为 Marker DL2000。从 3-5a 图可以明显看到胶孔处有亮带，说明 DNA 有蛋白质污染，进行两次抽提后得到电泳图 3-5b 看到胶孔处明显变干净，说明多次抽提对于 DNA 蛋白质的去除作用明显（见图 3-5）。
3.2.4 RNA 的去除
1,2,3,4,5 号泳道分别为试管中加入 0.1?l,0.2?l,0.3?l,0.4?l,0.5?l 的 Rnase，得到的 DNA的电泳图片，从实验中可以看出随着 Rnase 量的增加，RNA 带的亮度减小，说明 RNA含量变少，同时 DNA 的带也逐渐变弱，可能是 Rnase 能够消化部分的 DNA。同时还发现在抽提两次的胶孔处又出现了白色亮带，说明又有蛋白质污染。原因可能是因为 Rnase去蛋白酶属于蛋白质，在加入 Rnase 后虽能有效去除 RNA，但是又引入了新的杂质蛋白质。所以应该在加入 Rnase 之后再进行一次抽提，以除去 DNA 中的蛋白质（见图 3-6）。
3.3 小结
本部分试验采取分部优化的方式，试验结果发现在 CTAB 溶液中加入β-巯基乙醇能够有效防止 DNA 褐化，而且能够防止 DNA 降解，提高 DNA 的提取量。对于卡特兰多糖以及盐类等分子杂质的去除使用加入 CTAB 加 PVP 并且用预冷无水乙醇沉淀的方法最好，优于异丙醇沉淀，而且加入 NaCl 的方法不适合卡特兰。提取卡特兰过程中，用氯仿异戊醇进行两次抽提效果较好，蛋白含量明显减少。再通过加入 RNAse 的方法就能够去除样品中残存的 RNA。随着加入 Rnase 的含量 RNA 杂质减少，但同时 DNA 含量也在减少，而且蛋白质有所增加，所以最后需要再进行一次氯仿异戊醇抽提。所以，实验表明最适合的 Rnase 的量为 0.5?l，在此浓度下可以消除 RNA 同时还能保证 DNA 的含量。
采用上述分部试验得到的结果，将其组合成完整的方法步骤进行试验，即①将用液氮充分研磨后，装在 2ml 离心管中，加入 700?l 含 2%PVP 的 CTAB 溶液，和 14?lβ-巯基乙醇，震荡摇匀，水浴 40min。②加入 700?l 氯仿异戊醇，轻缓混匀，离心 12000 转10min。③吸取 400-500?l 上清液，转入新的离心管中。继续加入等体积氯仿异戊醇，进行二次抽提。④向吸出的上清中加入 0.5?l 的 Rnase，37℃水浴 30min。⑤向上清液中加入等体积氯仿异戊醇，12000 转离心 10min。⑥吸取上清，加入 2 倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，放入-20℃静置 40min，得到沉淀 DNA。⑦用 70%乙醇洗三次然后用无水乙醇洗涤晾干，晾干后溶于 200?lTE 溶液中，保存于 4℃。
按照此试验步骤提取 DNA 得到电泳图见图 3-7，紫外吸收值见表 3-3。从电泳图可以看出，DNA 条带清晰，胶孔清晰，没有条带弥散的现象，也没有 RNA 污染，说明 DNA纯净（见图 3-7）。用此方法提取的 DNA 的 OD260/OD280 在 1.8 到 2.0 之间，OD260/OD230都大于 2，说明 DNA 质量很纯净，不含杂质。含量在最少为 287.3ng/?l 以上，能够符合现在大部分分子技术对 DNA 的需求，达到了 DNA 优化的目的（表 3-3）。
