第六章 结论与讨论
6.1 结论
通过本次试验主要得到了以下结论：
第一，用 SDS 法、CTAB 法和试剂盒法的方法提取卡特兰 DNA，比较试验结果说明CTAB 法更适合卡特兰，通过对 CTAB 法的优化得到了适合卡特兰品种‘考娃’的 DNA提取的方法，发现加入 β-巯基乙醇能够保护 DNA，减少 DNA 的降解，加入 PVP 对去除多糖效果显着，加入 Rnase 能够有效去除 RNA，除了药剂之外实验中的操作步骤十分重要，一定要按照操作规范来进行，对于实验新手来说可能要经过长时间的摸索。实验步骤和配方如下。
第二，经过试验得到了适合卡特兰的提取方法。①将用液氮充分研磨后，装在 2ml离心管中，加入 700?l 含 2%PVP 的 CTAB 溶液，和 14?lβ-巯基乙醇，震荡摇匀，水浴40min。②加入 700?l 氯仿异戊醇，轻缓混匀，离心 12000 转 10min。③吸取 400-500?l上清液，转入新的离心管中。继续加入等体积氯仿异戊醇，进行二次抽提。④向吸出的上清中加入 0.5?l 的 Rnase，37℃水浴 30min。⑤向上清液中加入等体积氯仿异戊醇，12000转离心 10 分钟。⑥吸取上清，加入 2 倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀，放入-20℃静置 40min，得到沉淀 DNA。⑦用 70%乙醇洗 3 次后用无水乙醇洗涤洗涤晾干，晾干后溶于 200?lTE 溶液中，保存于 4℃。
第三，同一卡特兰植株由于叶片生长时间不同，所以新陈代谢中积累的物质不同，导致提取出的 DNA 质量和含量都有所差异。老的叶子中由于生长时间较长，积累了较多的次生物质，不仅在磨样难度较大，而且提取出的 DNA 质量较差，含量很低。而嫩叶和中叶提取出来的 DNA 质量和含量都比较高。所以建议选取嫩叶或者中叶进行实验。
第四，卡特兰的不同品种由于组织内含有物质略有差异，所以提取过程中现象会有所不同，但是差异较小，经过提纯能够得到高质量的 DNA，说明此方法对于卡特兰有一定的适用性。
6.2 讨论
在本次对卡特兰 DNA 提取试验的探索中发现主要有两个方面的问题影响 DNA 的提取效果，一是试验方法，二是实验操作的细节。
在实验方法的探讨上，CTAB 法一向适用于杂质含量较多的植物，虽然试剂盒提取效果开始优于 CTAB 法和 SDS 法，但是由于提取 DNA 含量少且价格昂贵，所以本试验以 CTAB 法为基本方法进行卡特兰 DNA 提取的优化。对于本试验对试验方法的研究说明在 CTAB 法提取 DNA 过程中加入 β-巯基乙醇，可防止叶片中的多酚物质氧化而使 DNA呈褐色，加入量只需要 2%体积即可。在后期沉淀 DNA 时，赵为等（2006)人在实验中发现对于含糖量高的植物加入 NaCl 溶液能够有效去除多糖，然而在本试验中加入 NaCl 却出现大量粉末状沉淀，而且在用 70%乙醇清洗时很难溶解，很有可能是卡特兰含有大量其他杂质，加入 NaCl 提高了溶液的浓度降低了该杂质的溶解度导致析出，或者是该体系内发生了系列的反应。在沉淀效果上，用醇类沉淀 DNA 时可以沉淀盐类和多糖等，实验发现无水乙醇和异丙醇沉淀 DNA 的效果相差不大，但是异丙醇对人体有害，所以在效果相近情况下尽量避免使用。而且异丙醇沸点较高，残留在 DNA 中的异丙醇不易除去，故一般使用乙醇沉淀，实验中发现加入 PVP 后，在用无水乙醇沉淀 DNA 时能够得到较多的絮状沉淀。
在实验开始阶段，由于操作不熟练，导致多次提取失败。所以规范细致的操作对于DNA 的提取以及其他分子技术来说是十分关键的。（1）首先研磨样品时的操作十分关键，主要为保持样品低温以及操作迅速，研磨用力。研磨时由于破碎细胞，细胞内的酚类物质释放出来和空气当中的空气发生反应，造成 DNA 降解，会影响 DNA 的含量和质量。
为了避免 DNA 降解，需要对研钵研棒进行预冷，同时装样品的离心管也要在液氮中进行预冷，否则快速操作研磨出来的低温的样品加入常温的离心管中，会发生溶化现象，粘连在试管壁上，影响 DNA 的含量。实验中发现研磨后的样品，放入-80℃保存，在未发生融化的情况下，两个月后取出仍然能够提出高含量高质量的 DNA，和提取新鲜叶片效果相似。（2）加入 CTAB 溶液和 β-巯基乙醇时一定要迅速，并且加入后震荡混匀，使它们混匀，并且水浴时隔 5min 混匀一次，让 CTAB 溶液与样品粉末迅速充分接触，达到裂解细胞，β-巯基乙醇防止 DNA 降解的作用。（3）加入氯仿异戊醇时需要注意避免剧烈震荡，因为此时 DNA 已经释放出来，剧烈震荡很容易导致 DNA 断裂，影响 DNA 质量。
同时吸取上清时中间白色混浊物是蛋白质，切忌贪多而吸入白色杂质。（4）加入 Rnase去除 RNA 时一定要严格遵守加入的量和水浴时间。同时实验中还发现水浴时间过长得到的 DNA 电泳图未发现 DNA 亮带，紫外吸光值分析也显示 DNA 含量很小，很有可能是Rnase 消化了部分 DNA。
对不同品种卡特兰提取 DNA 发现此实验方法也适用于‘绿精灵’，‘seto’‘大牛’等品种，提取出的 DNA 质量很高，说明此 DNA 提取方法方法对于卡特兰有一定的适用性。但是同时试验还有待继续扩大范围进行 DNA 的提取。
6.3 展望
相信随着科学技术的发展，一些基于新的提取原理的方法会出现，操作简便，提取效率高，适合自动化操作，能够批量提取 DNA，节省大量的人力和时间。目前卡特兰的新品种培育还仅依靠人工杂交，相信随着分子技术在卡特兰上的应用，分子育种会成为将来卡特兰育种的重要手段，当然作为目前研究较少的材料，这还需要一些时日。同时卡特兰丰富的花色以及沁人心脾的花香以后也会成为分子研究的重点。期待高新的分子技术能够尽早应用到卡特兰，培育出更多的新品种，让卡特兰为更多的人们所喜欢。
参考文献：
陈明莉, 王碧青, 朱根发. 卡特兰——兰花之王[J]. 花卉研究 20 年——广东省农业科学院花卉研究所建所 20 周年论文选集 (1984-2004), 2004.
李冬梅, 朱根发, 叶庆生. 大花蕙兰基因组DNA 提取及RAPD反应条件探索[J]. 热带亚热带植物学报,2006, 14(1): 25-30.
李金璐, 王硕, 于婧, 等. 一种改良的植物 DNA 提取方法[J]. 植物学报, 2013, 48(1): 72-78.
刘晓青, 陈尚平, 李倩中, 等. 卡特兰新品种的性状表现及其快繁技术[J]. 江苏农业科学, 2007 (6):275-276.
卢思聪. 卡特兰家族大特写 (上)[J]. 中国花卉盆景, 2011 (001): 4-9.
吕复兵, 蒋明殿, 朱根发, 等. 卡特兰杂交与种子无菌播种研究 [J]. 2007 年中国园艺学会观赏园艺专业委员会年会论文集, 2007.
吕复兵, 王碧青. 卡特兰生长发育规律初探[J]. 西南园艺, 2003, 31(2): 33-34.
裴杰萍,端青. DNA 提取方法的研究进展[J].微生物学免疫学进展, 2004,32(3):76-78.
钱桦. 卡特兰常见病虫害的防治[J]. 花木盆景: 花卉园艺, 2006 (3): 26-27.
仇建标, 丁文勇, 陈少波. 几种 DNA 提取方法对红树植物秋茄叶片 DNA 提取效果的比较[J]. 浙江海洋学院学报: 自然科学版, 2013, 31(5): 402-408.
邵和平, 高年春, 张宁宁, 等. 卡特兰开花特性鉴定与花期调控栽培技术[J]. 金陵科技学院学报, 2008,24(3): 70-75.
申丹, 曾杰, 周世良, 等. 4 种石山植物 DNA 提取方法筛选[J]. 广西科学, 2006, 12(4): 340-342.
王婵, 田保华, 裴雁曦, 等. 一种快速提取葱属植物 DNA 的方法[J]. 生物技术通讯, 2013, 23(6):860-862.
王国鼎, 文晓鹏, 季祥彪, 等. 11 种兰属植物 DNA 的提取及 RAPD—PCR 实验体系的建立与优化[J]. 种子, 2007, 26(3): 24-27.
王齐红,黄骥,张红生.一种快速微量提取植物叶片 DNA 的方法[J].生物技术通讯, 2004,15(5):479-480.
王雁，陈振皇，郑宝强，周照川，黄祯宏.卡特兰[M] .北京：中国林业出版社,2012肖鲲, 葛晓军, 李小琼, 等.改良 CTAB 法提取石斛总 DNA[J]. 贵阳医学院学报, 2007, 32(2):213-214.
杨少辉,张丽娟,段会军,等.大豆种子 DNA 提取方法[J].大豆科学,2003,22(2):151-153张海泉, 符晓棠, 张里占.不同植物根, 茎, 叶和种子的 DNA 质量比较[J]. 现代农业科技, 2006 (07S):82-84.
赵九洲. 洋兰生物技术研究及其应用[J]. 北方园艺, 2005 (4): 77-78.
赵姝华, 林凤.提取纯化植物 DNA 方法的比较[J]. 国外农学: 杂粮作物, 1998, 18(2): 35-38.
郑宝强. 卡特兰花期调控及其关键栽培技术研究[D]. 北京: 中国林业科学研究院, 2009.
郑宝强, 王雁, 潘治明. 卡特兰花期调控[J]. 中国花卉园艺, 2011 (8): 26-28.
郑宝强, 王雁, 彭镇华, 等. 杂种卡特兰花粉萌发和花粉贮藏性研究[J]. 热带亚热带植物学报, 2012,20(1): 13-18.
周延清.DNA 分子标记技术在植物研究中的应用[M].北京:化学工业出版社, 2005.
Csaik U M, Bastian H, Brettschneider R. Comparative analysis of different DNA extraction protocols: Afast, universal maxi-preparation of high quality plant DNA for genetic evaluation andphylogenetic studies [J].Plant,1998,(16):69-86．Phylogenetic Relationships among Cattleya and its Allied Genera[J]. Journal of the Japanese SocietyforHorticultural Science, 2004, 73(6): 583-591.
Lu P, Porat R, Nadeau J A, et al. Identification of a meristem L1 layer-specific gene in Arabidopsis that isexpressed during embryonic pattern formation and defines a new class of homeobox genes[J]. The PlantCell Online, 1996, 8(12): 2155-2168.
North C, Wills A B. Inter-specific hybrids of Lilium lankongense Franchet produced by embryo-culture [J].Acta Hort, 1969,16(7):18-43.
Stein N, Herren G, Keller B. A new DNA extraction method for high‐throughput marker analysis in a large‐genome species such as Triticum aestivum[J]. Plant Breeding, 2001, 120(4): 354-356.
Ozaki T, Shimada T, Nakanishi T, et al. RAPD analysis for parentage determination in Prunus mume Sieb. etZucc[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science (Japan), 1995.
Williams J G K, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers areuseful as genetic markers[J]. Nucleic acids research, 1990, 18(22): 6531-6535.
