第三章 结果与分析
3.1 花粉活力测定
采用 TTC 法对滇牡丹、‘凤丹白’、‘墨池争辉’、‘朱砂垒’的花粉进行花粉活力的测定，花粉染色率分别为 54.8%、55.9%、47.5%、41.4%。采用离体萌发法于 150 g?L-1蔗糖+H3BO330 mg?L-1+CaCl220 mg?L-1培养液中进行以上 4 种花粉活力的测定，花粉活力分别为 68.8%、71.3%、64.4%、52.1%。所测的花粉的花粉活力都较高，为以后的授粉试验提供了良好的实验基础。
3.2 切割柱头或花柱与切割柱头或花柱+花粉培养液法对牡丹花粉管生长的影响
以‘墨池争辉’为母本，滇牡丹为父本，授粉后不同时间花粉萌发状况以及花粉管生长情况见表 3-1。
通常不存在不亲和性障碍的情况下，异源花粉被授到柱头上后，经过吸水的花粉开始萌发，然后花粉管穿入柱头后，将伸进花柱，穿过珠孔，最终完成受精作用。在本研究‘墨池争辉’×滇牡丹中，由表 3-1 可以清晰的分析出，采用正常柱头授粉后经花粉培养液处理、切割柱头授粉后经花粉培养液处理和切割花柱授粉后经花粉培养液处理这三种授粉方式授粉后的花粉比正常柱头授粉、切割柱头授粉和切割花柱授粉这三种授粉方式授粉后的花粉提前萌发。正常柱头授粉后经花粉培养液处理，花粉在授粉 4 h 时开始萌发，而未经花粉培养液处理的正常柱头授粉后，花粉在 5h 时才开始萌发；切割柱头和切割花柱方式授粉后经花粉培养液处理，花粉在授粉 4 h 时开始萌发，而未经花粉培养液处理的切割柱头和切割花柱后授粉，花粉授粉 6 h 时开始萌发，可见花粉培养液能促使花粉提前萌发。萌发的花粉呈鲜亮的黄绿色（图 3-1a）。正常柱头授粉后，萌发的花粉管成团盘绕在柱头上，有些花粉管内出现大量不规则沉积的胼胝质，在紫外光下产生较强的荧光（图 3-1b）。少数花粉萌发后出现花粉管结合、顶端膨大（图 3-1c）的状况，并且停止了生长。
在花粉管生长时间相同的情况下，花粉培养液对正常柱头、切割柱头和切割花柱中花粉管生长的影响，只是略快于未经花粉培养液处理的方。在授粉 48 h 时，正常柱头授粉后经花粉培养液处理后花粉管的最长长度与未经花粉培养液处理的花粉管最长长度分别是 2965.45±22.13 μm 和 3012.68±15.47 μm；切割柱头方式授粉后经花粉培养液处理的花粉管的最长长度与未经花粉培养液处理的花粉管最长长度分别是 2178.34±18.23 μm 和2217.23±16.23 μm；切割花柱方式授粉用花粉培养液处理的花粉管的最长长度与未经花粉培养液处理的花粉管最长长度分别是 2003.45±14.67 μm 和 2040.68±14.21 μm，分析得出在授粉方式相同的前提下，花粉培养液在促进花粉管生长方面作用不显着。
授粉 10 h 时切割柱头授粉的花粉管达到了花柱的 1/30 处，但是花粉管伴有分叉和断裂的情况，同时伴随胼胝质的沉积（图 3-1d）。在授粉 12 h 时，正常柱头授粉后花粉管的生长长度（1041.49±20.12μm）都要比切割柱头后授粉和切割花柱后授粉的花粉管长度（1233.51±9.12 μm和1121.49±19.34μm）短，说明不亲和物质在柱头就开始表现。授粉12-24h，正常柱头授粉、切割柱头和切割花柱授粉花粉管增长量为 1040.27μm 、665.10 μm、668.27.00 μm；正常柱头授粉后经花粉培养液处理、切割柱头后授粉经花粉培养液处理和切割花柱后授粉经花粉培养液授粉花粉管的增长量分别为 1002.14 μm、658.54 μm、667.61μm，说明正常柱头对花粉管生长有积极作用。切割花柱方式授粉后 48 h，花粉管就开始停止生长（图 3-1f）。在授粉 48 h 时，正常柱头授粉的花粉管受来自花柱的阻力停止生长，进入到花柱的花粉管开始停止生长，花粉管开始产生分枝或者断裂的趋势，最终只能进入到花柱的 1/2 处（图 3-1e）。
授粉 48 h 时，正常柱头授粉经花粉培养液处理的花粉管最长长度为 3012.68±15.47μm，比切割柱头方式授粉经花粉培养液处理和切割花柱方式授粉经花粉培养液处理的花粉管最长长度分别长 745.45 μm 和 912.00 μm；正常柱头授粉后花粉管长度为2935.45±22.13 μm，比切割柱头后授粉和切割花柱后授粉的花粉管长 757.11 μm 和 923.00μm，切割柱头和花柱对花粉管生长作用有抑制作用，由此可以推断柱头对花粉管的生长具有十分重要的作用，这与徐艇（2007）所做的东方百合索蚌自交授粉实验结论相一致；切割花柱方式授粉的最长花粉管长度与正常柱头和切割柱头授粉长度差别显着，出现这种情况的原因可能是切割花柱后的母本不能为花粉的萌发提供良好的生长条件，甚至阻碍了花粉管的生长。极少数花粉管虽然进入花柱，但所有样品未见花粉管生长至子房处。
在滇牡丹ב墨池争辉’的杂交授粉试验中，授粉后不同时间花粉萌发状况以及花粉管最长生长长度见表 3-2。
花粉培养液处理的正常柱头授粉、切割柱头后授粉、切割花柱后授粉的花粉比未经花粉培养处理的花粉提前萌发。花粉培养液处理的花粉在授粉后 6 h 开始大量萌发，而未经花粉培养液处理的花粉在授粉后 8 h 才开始大量萌发。由此可以说明花粉培养液对花粉萌发有明显的刺激作用，并提供了花粉萌发所需的能量。但就花粉管的最长长度来看，用花粉培养液处理的正常柱头授粉、切割柱头后授粉、切割花柱后授粉 3 种处理方式最长花粉管长度分别是 1798.21±12.35 μm、1701.34±12.45 μm、1611.68±13.32 μm，而未经处理的花粉管最长长度分别是 1778.61±11.11 μm、1654.61±11.46 μm、1592.54±13.09 μm，可以看出花粉培养液对花粉管的生长作用不显着。在经花粉培养液处理和未经花粉培养液处理的授粉试验中，花粉萌发至 2 h 时，正常柱头授粉后经花粉培养液处理花粉管增长长度（287.78μm），比切割柱头和切割花柱授粉后经花粉培养液处理的花粉管增长长度（559.12 μm、514.12 μm）分别短 271.34 μm 和 226.34 μm，正常柱头授粉后花粉管增长长度（257.72 μm）比切割柱头和切割花柱后授粉花粉管增长长度（514.12μm、499.72 μm）分别短 256.40 μm 和 242.00 μm ，可见此时柱头对异源花粉的萌发和花粉管的生长有抑制作用，这是由于其不亲和的识别机制启动较早导致，杂交不亲和性在柱头上就开始表现。
此外本研究还发现，在授粉 12~48 h，相较于正常柱头授粉的花粉管长度，切割柱头后授粉和切割花柱后授粉的花粉管长度均有不同程度的缩短，证明切割柱头或花柱对花粉管生长作用不显着。
对‘墨池争辉’×滇牡丹与滇牡丹ב墨池争辉’的杂交授粉试验的花粉萌发、花粉管生长状况进行比较得出：‘墨池争辉’×滇牡丹的花粉比滇牡丹ב墨池争辉’的花粉先萌发，在滇牡丹ב墨池争辉’和‘墨池争辉’×滇牡丹中，花粉管在授粉后 48 h时开始停止生长，‘墨池争辉’×滇牡丹中，萌发形成的花粉管最长深入到花柱的 2/5 处，而滇牡丹ב墨池争辉’中的花粉管最长只长到了花柱的 1/3 处。出现以上情况的原因可能与杂交组合基因型差异以及授粉时的温度、湿度有关系。以上两种杂交组合的授粉方式的处理，最终都没能使花粉管穿过花柱，进入到胚珠完成受精作用。花粉培养液能促进花粉提前萌发，但对花粉管的伸长作用不明显；切割柱头方式授粉从花粉萌发到授粉 12 h 时花粉管生长速度（188.91 μm/h）显着高于正常柱头授粉花粉管生长速度（177.35μm/h），切割柱头对花粉管生长作用显着，说明远缘杂交不亲和物质在柱头就开始表现，但在授粉 12 h 后，切割柱头方式授粉的花粉管生长缓慢，最终长度（1654.61±11.46 μm）也比正常柱头授粉的长度（1778.61±11.11 μm）短，由此得出柱头的存在对花粉管生长有影响。
3.3 激素处理对牡丹花粉管生长的影响【1-2】
以‘朱砂垒’为母本，滇牡丹为父本，授粉后不同时间花粉萌发状况以及花粉管最长生长长度见表 3-3。授粉 6 h 时，经 BA、GA3、NAA 3 种激素处理后，花粉全部在柱头萌发，此时的花粉管还没有突破柱头组织。而正常柱头授粉花粉在授粉后 4 h 就开始萌发，比用激素处理方式授粉后花粉提前萌发，说明此时激素对花粉的萌发有一定的抑制作用。在授粉后 12 h 时，经 BA、GA3、NAA 3 种激素处理后花粉管最长长度分别达到了 682.21±12.14 μm、521.43±14.12 μm、510.68±11.98 μm，而未经处理直接授粉花粉管的最长长度为 1234.57±11.98 μm，分别比 BA、GA3、NAA3 种激素处理的花粉管最长长度大 552.36 μm、713.14 μm、723.89 μm，说明激素对花粉管的生长表现出了抑制作用。图3-1 g 为经 BA 处理授粉 12 h 后，花粉管的生长情况。图 3-1 h、i 分别为经过 BA 处理后6 h 和 12 h 花粉管生长情况。
但在授粉 12~24 h，用 BA、GA3、NAA 3 种激素处理的花粉管的生长势开始加强，花粉管的最长长度分别达到了 2897.92±11.98 μm、2631.98±13.12 μm、2576.34±12.57 μm，与授粉 0~12 h 相比，花粉管生长量呈明显的上升趋势，可见在处理 12 h 后激素对花粉管的生长促进作用显着，并且经 BA 处理过的花粉管生长势比经 GA3和 NAA 处理的强。
尽管激素对花粉管的后期生长有发挥了积极的作用，但花粉管在向花柱延伸的过程中，同时发现有大量的胼胝质呈颗粒状沉积。部分花粉管开始出现分枝或相互结合等现象。
在授粉后 24 h~48 h，正常柱头杂交授粉花粉管的增长量（1033.87 μm）与用 BA、GA3、NAA3 种激素处理方式授粉的花粉管的增长量（1100.2 μm、1080.36 μm、 1051.11μm）差异不显着，其主要原因可能是随着时间推移，激素消耗完全，它对花粉管生长的刺激作用不存在了，因此花粉管的生长缓慢。授粉 48h 时，所有授粉方式处理的花粉管均已停止生长，最长也没能穿过花柱进入胚囊完成受精作用。最终不同处理对花粉管最长长度的影响为 BA>GA3>NAA>CK，通过显着性分析可知 3 种激素的花粉管生长影响顺序为 BA>GA3>NAA（表 3-4）以滇牡丹为母本，‘朱砂垒’为父本，授粉后不同时间花粉萌发状况以及花粉管最长生长长度见表 3-5。
未经激素处理的柱头，花粉在 5 h 时开始萌发；经过激素处理的柱头，花粉在 6 h 时开始萌发。可以看出激素对花粉的萌发产生了抑制作用。
在授粉的 12 h，用 BA、GA3、NAA 激素处理过的花粉管最长长度（682.21±12.12 μm、510.68±11.23 μm、521.43±11.98 μm)比正常的花粉管最长长度(1134.57±11.35 μm)分别短（452.36 μm、623.89 μm、613.13 μm），这说明激素对花粉管的促进效应存在“滞后”现象。在授粉 24 h 时，用 BA、GA3、NAA 激素处理方式授粉的花粉管明显比正常柱头授粉的花粉管生长的快，花粉管最长长度分别达到 2897.92±12.41 μm、2376.34±11.97 μm、2631.98±12.34 μm，而未经激素处理花粉管长度为 1978.25±12.78 μm。
在授粉 24~48 h，正常柱头杂交授粉花粉管的生长速度与用激素处理方式授粉的花粉管生长的速度差异不显着，这可能是随着时间推移，激素逐渐消耗完毕，花粉管生长速率减缓。
授粉 48 h 时，所有授粉方式处理的花粉管均已停止生长。最终花粉管最长长度与激素对花粉管生长量的影响呈正相关即 BA>NAA>GA3>CK，通过显着性分析可知 3 种激素的花粉管生长影响顺序为 BA>GA3>NAA（表 3-6）将‘朱砂垒’×滇牡丹杂交授粉试验与滇牡丹ב朱砂垒’杂交授粉试验花粉管萌发及花粉管生长状况进行比较可知：激素在授粉 0~12 h 期间对花粉的萌发和花粉管的伸长产生了抑制的作用，推测可能是由于激素的浓度过高引起的。在授粉 12 ~24 h，经激素处理的花粉管生长势明显加强，激素对花粉管的生长作用显着。3 种激素对以‘朱砂垒'为母本的授粉试验花粉管长度的影响关系为 BA＞GA3＞NAA；对以滇牡丹为母本的授粉试验花粉管长度的影响关系为 BA＞NAA＞GA3。BA 处理效果比其他两种激素处理的效果显着，NAA 与 GA3花粉管生长的作用存在显着差异，导致这种差异性的原因可能与杂交组合的差异有关系。3.4 ’凤丹白‘自交、杂交授粉试验【3】
以’凤丹白‘为母本，滇牡丹为父本；以滇牡丹为母本，’凤丹白‘为父本以及’凤丹白‘自交；授粉后不同时间花粉萌发状况以及花粉管平均生长长度见表 3-7。
在’凤丹白‘的自交试验中，人工授粉 2 h 之后，花粉就开始大量的萌发，萌发的花粉呈鲜亮的黄绿色。萌发后的花粉形成的花粉管，不断的延伸，穿过出头，深入到花柱。
授粉 10 h 后，花粉管达到子房，完成受精作用。
以’凤丹白‘为母本，滇牡丹为父本的授粉试验中，授粉 5 h 时，花粉还未萌发（图3-1j)。授粉 5 h 后，花粉管开始大量的萌发，观察到大量的花粉管进入到柱头，深入到花柱，进入到花柱中的花粉管收到来源于花柱的阻力开始出现扭曲、分叉以及顶端膨大等现象，表明花柱对花粉管的生长抑制作用明显，授粉 48 h 后花粉管停止生长，花粉管最长长度为 4812.21±11.99 μm，达到了花柱的 3/5 处，但花粉管没能伸长到胚珠。
在以滇牡丹作父本的杂交授粉试验中，正常柱头授粉，滇牡丹花粉萌发形成的花粉管最长长度关系为’凤丹白‘＞’朱砂垒‘＞’墨池争辉‘。说明滇牡丹与’凤丹白‘亲和性要比其他品种的亲和性要高。远缘杂交亲和性除了与授粉时期母本花期温度和湿度有一定的关系外，品种间的亲缘关系的远近也对杂交亲和性有重要的影响。由此推断在亲缘关系上’凤丹白‘与滇牡丹的亲缘关系更近一些。
在以滇牡丹作母本的杂交授粉试验中，正常柱头授粉后花粉管的最长长度关系为’凤丹白‘＞’朱砂垒‘＞’墨池争辉‘。实验结果说明’凤丹白‘与滇牡丹亲和性比其他作为试验的中原品种的亲和性要高。
将以滇牡丹作父本的杂交授粉试验和以滇牡丹做母本的杂交授粉试验同等处理条件下的花粉管的萌发时间和花粉管的最长长度做比较分析得出：（1）花粉开始萌发时间长短关系为：滇牡丹作父本杂交授粉试验＜滇牡丹作母本的杂交授粉试验（2）花粉管最长长度比较结果为：滇牡丹作父本杂交授粉试验＞滇牡丹作母本的杂交授粉试。
