第二章 研究材料与方法
2.1 实验材料
用于杂交的中原牡丹品种有：‘凤丹白’（‘Feng Dan Bai’）、‘朱砂垒’（‘Zhu Sha Lei’）‘墨池争辉’（‘Mo Chi Zheng Hui’）（图 2-1a、b、c）由中国林业科学研究院玉泉山牡丹基地提供，该基地以上 3 个品种自然结实力较强，栽培面积较广。滇牡丹（P.delavayi）（图 2-1d）取自于滇西北香格里拉县城以西 25 km 左右的滑雪场附近（27°57′N，99°35′E），是目前我们调查发现的滇牡丹最集中、花色最丰富、面积最大的分布区域（李奎，2012）。
本区属温带高原半湿润季风气候，海拔 3318 m，年平均气温 5.9 ℃，最冷月平均气温-0.4 ℃，最热月平均气温 13.3 ℃，无霜期 123.8 d，年降水量 648.6 mm，年蒸发量 1616.8mm，年日照时数 2155.9 h，年平均相对湿度 69%，10 ℃以上积温 1539.2 ℃（以上气象数据来源于迪庆州气象局）。
2.2 试验方法
2.2.1 花粉采集及花粉活力的测定
2013 年 4 月份于北京采集玉泉山中原品种‘凤丹白’、‘墨池争辉’、‘朱砂垒’初开花朵中的花药，此时的雄蕊成熟，将其带回室内阴干，收集散出的花粉，装入有硅胶的瓶中，置于 4℃冰箱内贮藏备用。将采集来的花粉以及保存在-80 ℃的滇牡丹花粉参照律春燕等（2009）方法，进行花粉活力的测定。花粉离体萌发法的试验方法为在双孔凹型载玻片孔内滴入 0.1 mL 的花粉培养液，将花粉均匀地点入培养液中，将载玻片放入保湿的培养皿内，置于 25 ℃人工气候箱中光照培养 4 h。在 40 × 显微镜下观察统计，每处理统计 10 个视野，每个视野花粉不少于 50 粒，至少 3 个重复。实验数据使用 SPSS 12.0进行处理。
2.2.2 人工套袋及去雄
在母本花蕾风铃期或露色期用镊子或徒手将花瓣和雄蕊掐掉或撕掉，去雄完全的母本用硫酸纸袋套在花头上并用回形针将袋口轧紧，避免风媒或虫媒将其他花粉带到柱头上影响授粉结果。
2.2.3 实验材料杂交组合及授粉方法处理【1】
2.2.3.1 切割柱头或花柱授粉和切割柱头和花柱+花粉培养液授粉
分别选取北京玉泉山基地的‘墨池争辉’和云南香格里拉滑雪场的滇牡丹优良单株作为母本进行授粉，参照李奎等（2013）柱头可授期时间和研究方法。具体授粉方式分如下几种：1.正常柱头授粉（CK)；2.仅切割柱头后授粉；3.切割全部花柱后授粉；4.将花粉授于正常柱头上，缠上浸有花粉培养液的脱脂棉，并包上保鲜膜；5.仅切割柱头后授粉，缠上浸有花粉培养液的脱脂棉，并包上保鲜膜；6.切割全部花柱后授粉，缠上浸有花粉培养液的脱脂棉，并包上保鲜膜。切割柱头或花柱的做法是用刀片削去柱头或花柱。每种授粉方式授粉 70 朵花，其中 20 朵花用于留种，授粉后，挂牌标记杂交组合、授粉时间。
花粉培养液配方为：150 g?L-1蔗糖+H3BO330 mg?L-1+CaCl220 mg?L-1，此配方参考律春燕（2010）的花粉培养液配方。
花粉管生长状态观察：授粉后的 0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h 时，分别取下 10 个心皮，放入 FAA 固定液中固定，于 4℃冰箱里保存。样品均用 8 mol· L-1NaOH 溶液软化处理，用蒸馏水反复冲洗后，用 0.1% 脱色的水溶性苯胺蓝溶液染色 5~10 h，压片（Kho YO & Bear J，1968），置于 300~400 nm的荧光显微镜（ZeissAxioskop 40）下观察花粉粒的萌发、花粉管进入柱头及其在花柱中的生长情况，并进行拍照记录，参照关军峰等（1999）的方法进行花粉管长度统计，所得数据用 SPSS 12.0 进行统计分析。
2.2.3.2 激素处理
分别选取北京玉泉山基地的‘朱砂垒’和云南香格里拉滑雪场的滇牡丹优良单株作为母本进行授粉，处理方法是：先配好浓度均为 0.1mg?L-1的 3 种激素 BA、GA3、NAA，，具体授粉方法为以下几种：1.不做激素处理（CK)；2.将花粉直接授在柱头上，缠上浸有BA 激素的脱脂棉，并包上保鲜膜；3.将花粉直接授在柱头上，缠上浸有 GA3激素的脱脂棉，并包上保鲜膜；4.将花粉直接授在柱头上，缠上浸有 NAA 激素的脱脂棉，并包上保鲜膜。授粉后，立即用硫酸纸袋将柱头保护起来，防止风或昆虫将其他的花粉带到柱头上。每种授粉方式授粉 70 朵花，其中 20 朵花用于留种，授粉后，挂牌标记杂交组合、授粉时间。
花粉管生长状态观察同 2.2.3.1。2.2.3.3 自交和杂交授粉试验方法：分别选取北京玉泉山基地的‘凤丹白’和云南香格里拉滑雪场的滇牡丹优良单株作为母本进行授粉，授粉分以下 3 种情况‘凤丹白’自交、‘凤丹白’×滇牡丹、滇牡丹ב凤丹白’。每种授粉方式授粉 70 朵花，其中 20 朵花用于留种，授粉后，挂牌标记杂交组合、授粉时间。
花粉管生长状态观察同 2.2.3.1。
2.2.4 结实情况统计
对以上 3 种授粉处理方式的 3 个杂交组合的结实情况进行统计，统计方法参考 Li 等（2013）。结实率=种子数/授粉朵数，采用 SPSS 12.0 软件对统计结果进行分析。
