【摘要】 目的 因原料血浆不足，作为治疗血友病 A 的唯一有效用药人凝血因子Ⅷ资源短缺，而运用基因工程生产的重组人凝血因子Ⅷ能很好的解决这些问题。本文从人凝血因子Ⅷ的结构改造、载体及表达系统、基因治疗和前沿基因编辑技术的应用等几个方面对 FⅧ在基因工程中的研究进行总结及展望。
【关键词】 重组人凝血因子Ⅷ; 基因工程; 基因治疗
人凝血因子Ⅷ作为治疗凝血障碍性疾病血友病 A的惟一有效用药，主要有两个来源。一是血浆离心后获得的冷沉淀中分离的人凝血因子Ⅷ( coagulation fac-tor Ⅷ，FⅧ) ; 二是通过基因改造获得的重组人凝血因子Ⅷ( recombinant FⅧ，rFⅧ) 。而利用基因工程手段生产的 rFⅧ相比于 FⅧ具有以下优势: ( 1) 不受原料血浆产量的限制; ( 2) 患者接受治疗后感染病毒性肝炎和艾滋病等传染性疾病的风险更低; ( 3) 产品的稳定性更强。李文卿［1］研究证实了重组人凝血因子Ⅷ在中国血友病 A 患者的治疗中具有较好的有效性、安全性及较低的抑制物产生率。所以，面对国内凝血因子Ⅷ短缺、进口国外的基因重组凝血因子产品价格相对昂贵的困境，提高凝血因子Ⅷ的产量和利用率是一方面，另外对重组人凝血因子Ⅷ的研究和开发，生产中国自己的人重组凝血因子Ⅷ的产品，具有广阔的应用前景和积极的意义。本文从人凝血因子Ⅷ的结构改造、载体及表达系统、基因治疗和前沿基因编辑技术的应用等几个方面对 FⅧ在基因工程中的研究进行总结。
1、人凝血因子Ⅷ的结构及其改造
1． 1、人凝血因子Ⅷ的结构 自 Wood 等［2］克隆人凝血因子Ⅷ的基因，解析了该基因的 cDNA 序列，并成功表达提取 rFⅧ以来，FⅧ的基因和蛋白结构逐渐被人们所探知。FⅧ的基因由 26 个外显子和 25 个内含子组成，其中 14 和 26 两个外显子最大，分别为 3 106 bp和 1 958 bp，全长 186 kb，位于 X 染色体长臂末端，约占整个 X 染色体的 0． 1%。FⅧ基因经过转录、剪切后的 mRNA 长约 9 kb，编码一条包含 2 351 个氨基酸残基的前体。信号肽在内质网中被水解后，形成含有2 332个氨基酸残基，6 个结构域的成熟 FⅧ单链蛋白。
根据 FⅧ内部序列的同源性的关系，FⅧ可分为A、B、C 三种结构域，其中: A 结构域可分为 A1、A2、A3三种，每个约含 350 个氨基酸残基，具有 30% 的同源性，A1、A2 位于重链，A3 位于轻链; B 结构域为重链，位于分子的中部，共有 908 个氨基酸残基; C 结构域位于轻链的 C 端，分为 C1、C2，每个约有150 个氨基酸残基，具有 40% 的同源性。Stoilova-McPhie 等［3］通过电子显微镜技术成功得到了 FⅧ的晶体结构。FⅧ的 A3区位于细胞膜磷脂双分子层且紧邻 C1 和 C2 区; C1 区的长轴与细胞膜平面大约平行且与 C2 几乎垂直; A1、A2 和 A3 区之间互有微小角度且均有 2 个高度保守的β 桶装结构域。整个分子排列成 A1-A2-B-A3-C1-C2［4］。通过与细胞内外的多种结构的蛋白和酶之间复杂的相互作用，从而影响着 FⅧ的蛋白质活性、跨膜转运和基因表达等。
1． 2、人凝血因子Ⅷ结构的改造 尽管重组人凝血因子Ⅷ对于血友病 A 患者的治疗效果显着，但因人凝血因子Ⅷ的基因较大，表达水平低和极易降解等缺陷，寻找合适的途径和表达载体显得尤为重要。通过对 FⅧ基因结构的改造，能有效的提高 FⅧ在细胞中的表达。当前，对于对 FⅧ基因结构的改造有以下几个方面:
(1) 缺失 B 区: FⅧ的 B 区结构域占整个分子的大约40% ，但 B 区缺失型 FⅧ与野生型 FⅧ具有相似的生物学特征，FⅧ基因的 B 区在加工的过程中被剪切，其与基因表达和凝血功能等关系不大。且 B 区缺失型 FⅧ没有载体包装容量的的缺陷，表达产物也更为简单朱甫祥等［5］研究了将 FⅧ基因在大肠杆菌中分别表达的重链和轻链，利用内含子介导的蛋白剪切法进行拼接。随后，将促进重链分泌的基因区导入其中，经双载体共转染的方式，获得了高活性和高表达量的 B 区缺失型 FⅧ。Pittman 等［6］将 FⅧcDNA 的若干结构域去除后获得的 B 区缺失型 FⅧcDNA 插入逆转录病毒载体，基因的表达量不仅比野生型有较大程度提高，而且表达产物的生物特性及免疫原性与野生型相同。另外，美国辉瑞、韩国绿十字等几家医药公司已有 B 区缺失或保留 B 区部分氨基酸的重组 FⅧ成功上市［7］。
(2) 定点突变: 通过对氨基酸位点的定点突变，减少 FⅧ在分泌途中与相关蛋白结合，从而提高其表达量; 通过特定结构改造的 FⅧ能抵制特定蛋白对其作用位点接切后的抑制，增强了 FⅧ的稳定性。Wakabayashi等［8］通过对包埋在分子内部、带电荷较多的 4 个位点进行突变，突变产物相比于野生型的凝血活性和热稳定性均有很大程度的提高。细胞内蛋白的相互作用会抑制 FⅧ的表达。Miao 等［9］设计了 F309S 的突变位点，降低 FⅧ在分泌过程中与 BiP 的相互作用; 有研究表明通过突变 2 个半胱氨酸的位点，消除了二硫键对分泌蛋白的影响，表达量均有显着提高［10］。( 3) 聚乙二醇修饰: 聚乙二醇修饰又称 PEG 化，是将活化的聚乙二醇与蛋白质分子相偶联，进而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变。通过 PEG 化，能增强蛋白质分子化学稳定性，提高抵抗蛋白酶水解能力，降低蛋白免疫原性及延长蛋白在体内的半衰期。
进行 PEG 化的半胱氨酸残基在 B 区缺失型 FⅧ中一共含有 19 个，其中 16 个以二硫键相互配对，另外3 个包埋在分子内部。所以需要通过定点突变等方法引入新的半胱氨酸残基进行 PEG 化。Mei 等［11］研究了不同位点引入单个半胱氨酸残基进行 PEG 化，结果表明，大多数经过 PEG 化的 FⅧ突变体的生物活性与野生型效果相同，且在半衰期和治疗效果均优于野生型 FⅧ。另外，在 B 区还有4 个半胱氨酸残基，Turecek等［12］通过对重组全长的 FⅧ进行定点 PEG 化，大部分修饰位点处于 B 区，经 PEG 化的 FⅧ的结构和功能没有影响。因此，PEG 化作为一个有效的手段，拜耳、百特等医药公司已有相关的定点氨基酸 PEG 化的重组FⅧ进入临床，以后将会给血友病 A 患者带来福音［7］。
另外，为延长重组 FⅧ的半衰期，在 FⅧ末端和 B区缺失的 FⅧ末端融合表达 IgG 的 Fc 片段; 利用 PEG化脂质体非共价包裹 FⅧ等。FⅧ作为结构复杂的蛋白质药物，随着对 FⅧ结构和功能的深入研究，将会研制出高效、安全、价廉的重组 FⅧ产品。
2、重组 FⅧ的表达载体及系统
通常的载体有三种，细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。它们是一类能将目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA 或 RNA 分子。在重组 FⅧ载体的构建中，这三种类型均有所应用，细菌质粒和动物病毒的应用更为普遍。病毒载体以其宿主范围广、载体容量大及操作简单等优势得到广泛应用，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒及单纯疱疹病毒等病毒载体均有相关研究报道。
表达系统中，原核生物表达系统操作简便，却在表达真核来源的重组 FⅧ蛋白时存在一些缺陷，如二硫键的错误链接、肽链不能有效折叠及糖基化效率低等问题，故应用并不广泛。现今的研究关注更多的是真核微生物和动物细胞类的表达载体，王泽［13］将分泌性载体 Ppic9 导入甲醇诱导性毕赤酵母中进行重组 FⅧ的表达，成功的表达出重组 FⅧ，为重组 FⅧ表达系统的扩展研究提供基础。孙夏瑜［14］通过克隆 FⅧ基因的 cDNA，利用杆状病毒-昆虫表达系统成功地制备了具有凝血活性的重组 FⅧ。赵倩［15］通过构建含有 BD-Dh FⅧ的重组真核表达质粒，转染入 HepG2 细胞中，得到了能稳定表达重组 FⅧ的细胞株。生产应用最多的表达系统还是中国仓鼠卵巢细胞( CHO) ，通过载体转染 CHO，细胞培养后，通过亲和层析等蛋白分离技术获得重组 FⅧ，有些产品已成功上市。
3、基因治疗
血友病 A 的主要发病机制是内含子 22 的倒位和错义突变。随着科学家对 FⅧ基因和蛋白质结构的透彻研究，加之个体对 FⅧ的正常生理水平要求较低，许多器官均能产生有活性的 FⅧ。因此，血友病 A 作为体细胞基因治疗的首选疾病。
3． 1、体外治疗 体外治疗指的是先从患者体内取出某一组织的细胞，通过体外扩增培养后，将携带有重组FⅧ基因的载体转染到受体细胞中，筛选出转染成功的细胞移植到患者体内，进而通过这些移植的细胞表达出 FⅧ来达到治疗的目的。Van Damme 等［16］将携带有 B 区缺失型 FⅧ的逆转录病毒载体转染至人骨髓间充质细胞中，然后将成功转染的重组细胞移植到免疫缺陷的 NOD-SCID 小鼠中，重组 FⅧ在小鼠体内的表达量对于治疗有显着价值。因病毒载体的不安全性，纤维细胞、成肌细胞等取材方便、体外扩增迅速的组织细胞在临床中得到应用。
3． 2、体内治疗 体内治疗是指将能表达 FⅧ的载体直接注入患者机体。目前最为安全的治疗方法是向患者体内直接注射不含载体的裸 DNA，通过体内肝细胞的转染，自身表达 FⅧ来进行治疗，这是一个比较有效的体内治疗方法。另外，通过转座子对哺乳动物基因的高效整合，将真核生物的含有 FⅧ基因转座子载体导入受体体内，表达 FⅧ达到治疗目的。但因转座子整合基因位置的不确定，这种方法的安全性还需进一步验证。刘雄昊［17］通过构建携带有 h FⅧ-SK39 的核糖体基因区靶向表达载体电转染至人肝细胞中，采用高水压注射法将载体直接通过尾静脉注射到裸鼠体内，结果显示该载体在小鼠体内得到有效表达，这为血友病的基因治疗开拓了新的思路并奠定了基础。
不得不提的是，随着最近几年一种全新的基因编辑技术 CRISPR( 规律成簇间隔短回文重复序列) 的诞生，科学家只需要设计一段几十个碱基的 CRISPR，利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组的具体靶点上，便能对特定基因位点进行切割导致突变。
这项技术应用在基因敲除、基因编辑相关的疾病、基因的激活和表达等多个领域。CRISPR/Cas9 还可以作为一种精确的基因剪切工具运用在真核细胞的转录调控研究中。将 CRISPR/Cas9 应用在重组 FⅧ的研究中，不仅能简化基因编辑操作步骤，更重要的是其精准的定位能极大了提高重组效率，减少因剪切带来的基因片段的残留或缺失，这可以提高转染成功率，同样在表达系统中能使表达的重组 FⅧ正确折叠，进而提高重组 FⅧ收率。CRISPR/Cas9 在血友病 A 的基因治疗方面同样有革命性的应用前景，相信将这项技术应用在重组 FⅧ的研究中将具有深远的意义。
在我国 30 多家血液制品生产厂家中仅有 4 家生产人凝血因子Ⅷ，且还没有国内公司生产重组 FⅧ的产品，产量远远不能满足血友病患者的需求，进口的重组 FⅧ以其安全、高效的优势已被越来越多的血友病患者所接受。通过转基因技术的进一步发展，相信在不久的将来，现今存在的受体产生免疫反应、插入突变及 CRISPR/ Cas9 的脱靶等问题将会得到解决，重组 FⅧ的永久性表达的也将会实现。
