支气管哮喘中医“同病异证”性理论研究
时间：2014-08-27 来源：未知 作者：小韩 本文字数：3775字
支气管哮喘(bronchial asthma)简称哮喘,是由多种细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]
,中医学属于哮病范畴。现今全球哮喘患者约有1.5亿,造成的损失超过结核病和艾滋病的总和,发达地区哮喘的发病率高于欠发达地区[2]
,污染地区哮喘的发病率高于非污染地区,许多发达国家哮喘患病率呈上升趋势[3]
,我国哮喘的发病率低于发达国家,死亡率位居全球第一,严重影响我国公民的身体健康,造成了巨大的社会医疗负担[4]
。本课题组既往研究发现肾虚痰瘀型哮喘的病机最 为复杂,病情较其他证型偏重,治疗效 果较差[5]
。复杂性疾病的背后往往是整体生物学基础紊乱的状态,“证”能够反映疾病过程在某一个阶段的病理生理症状与体征群,代表复杂性疾病及其背后整体生物学基础紊乱状态。代谢组学通过从整体上观察生物学的内在系统信息,判断出生物体的病理生理状态;核磁共振(NMR)代谢组学技术作为一种高效非破坏性分析方法在现代医学[6-7]
及传统医学研究中已广泛应用[8-9]
。本研究利用代谢组学平台,通过对健康人、肾虚痰瘀型哮喘患者、非肾虚痰瘀型哮喘患者血浆进行检测和分析,从样品中得到小分子物质谱图,探寻肾虚痰瘀证特异性代谢产物,确定中医“同病异证”生物学物质基础,丰富支气管哮喘中医“同病异证”性理论。
1 资料及方法
1.1 临床资料
通过体检确定身体健康的志愿者61例(健康组),其中男性30例,女性31例,平均年龄为18~60岁。选择2012年10月-2013年9月在新疆医科大学附属中医医院呼吸科就诊的支气管哮喘患者140例(哮喘组),其中肾虚痰瘀证哮喘组70例,非肾虚痰瘀证哮喘组70例(冷痰哮、热痰哮、寒包热痰哮、风痰哮),经入院检查确诊,年龄16~60岁,详细记录病人基本信息(病史、性别、年龄、族别等)。中华医学会呼吸病学分会支气管哮喘学组制定的“支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗及教育和管理方案)”为支气管哮喘诊断标准;根据《中医诊断学》[(人民卫生出版社(第5版)]及《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》拟定中医肾虚痰瘀证标准。哮喘组纳入标准:(1)年龄18~70岁;(2)符合支气管哮喘的诊断标准;(3)处于急性发作期并在急性发作的患者和曾经有支气管哮喘发作史的非发作期患者;(4)在新疆生活居住时间≥10a的居民。排除标准:(1)经检查证实为结核、真菌、矽肺、肿瘤等因素所致,持续性慢性咳嗽、喘息患者;(2)明确诊断合并有原发性心血管疾病、肝脏病变、肾脏疾病、糖尿病、造血系统疾病、精神病等患者及其他严重并发症的患者;(3)无法确诊或资料不全的患者。
1.2 样品的采集与血浆核磁共振氢谱的测试
1.2.1 样品的采集经患者和健康志愿者知情同意,采清晨空腹肘静脉血,肝素钠抗凝,4℃3 000r/min离心10min,分离血浆,置-80℃超低温冰箱保存。
1.2.2 血浆核磁共振氢谱的测试血浆样品经室温解冻后,取血浆200μL加正磷酸盐缓冲液400μL[溶质:0.45mol/L Na2HPO4,0.45mol/L K2HPO4;溶剂为80%H2O/20%D2O(含TSP 0.05%),pH=7.4]混匀,去除pH化学位移影响,室温放置10min后,10 000r/min离心10min。取550μL上清液加入5mm核磁管。
Inova 600MHz核磁共振波谱仪进行1H-NMR谱的测定,调用CPMGPREST-1D脉冲序列(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)进行检测。测定温度设定为25℃,预饱和方式抑制水峰,饱和时间为2s,采样点数32k。扫描次数128次,谱宽为10 000Hz。
谱图中的各种峰的指认,选取已测1H-NMR谱数个样品进行1H-1H同核相关谱(1H-1H COSY,1H-1HHomonuclear correlation spectroscopy)、质子全相关谱(TOCSY,Total correlation spectroscopy)、J-分解谱(J-RES,J-resolved spectroscopic)二维谱测试,辅助代谢成分的鉴定。
1.3 数据处理与分析
1.3.1 数据处理血浆样品1H-NMR谱经基线及相位调整后,以α葡萄糖左峰作为化学位移参考峰的位置设为5.233ppm。选择δ9~δ0.5ppm的区域进行自动分段积分,积分区间设为0.003ppm,积分结果以文本格式保存导人到Excel表内,去除δ4.66~δ5.22ppm范围水峰信号,对各分段积分值进行归一化(样品每一段积峰值与所有积峰值和的比值)后进行模式识别分析。
1.3.2 数据分析采用SIMCA-P+11软件进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),经统计分析获得每一积分段所代表的代谢产物的相关系数 (r),确定健康组与肾虚痰瘀型哮喘组、肾虚痰瘀型哮喘组与非肾虚痰瘀型哮喘组血浆中差异性代谢产物成分,通过皮尔森相关系数显着性差异检测(相关系数的临界值相当于显着性差异水平,P <0.05),确定0.250、0.232作为代谢物变化是否具有显着性差异的阈值 (n =60|r|>0.250,n =70|r|>0.232),相关系数绝对值大于阈值代表的代谢物差异有统计学意义 (P <0.05)。
2 结果
通过1H-NMR谱图和COSY、TOCSY、J-RES等二维谱对健康组与肾虚痰瘀型哮喘组、肾虚痰瘀型哮喘组与非肾虚痰瘀型哮喘组血浆中差异性代谢产物成分进行了信号归属。健康组、肾虚痰瘀型哮喘组及非肾虚痰瘀型哮喘组血浆1H-NMR谱图见图1。健康组与肾虚痰瘀型哮喘组、肾虚痰瘀型哮喘组与非肾虚痰瘀型哮喘组血浆1H-NMR谱图进行OPLS-DA分析的结果空间分布图见图2(OPLS-DA分析的结果空间分布图中1个点代表1个标本,健康组与肾虚痰瘀型哮喘组、肾虚痰瘀型哮喘组与非肾虚痰瘀型哮喘组空间位置区域分开,表明各组样品的代谢成分有差异)。健康组、肾虚痰瘀型哮喘组及非肾虚痰瘀型哮喘组血浆中差异性代谢产物见表1。【表1略】
健康组与肾虚痰瘀型哮喘组、肾虚痰瘀型哮喘组与非肾虚痰瘀型哮喘组的代谢表型发生了变异,OPLS-DA分析空间分布图可见各组分类情况较好。肾虚痰瘀型哮喘组与健康组比较,血浆中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、谷氨酰胺、肉碱、酪氨酸、肌酸、组氨酸、鲨肌醇、甘氨酸、葡萄糖、苏氨酸、肌醇、1-甲基组氨酸降低,肌酸升高,差异有统计学意义 (P <0.05);肾虚痰瘀型哮喘组与非肾虚痰瘀型哮喘组比较,肾虚痰瘀型哮喘组血浆中丙酮酸、甘氨酸等化合物含量较高,差异有统计学意义 (P <0.05);非肾虚痰瘀型哮喘组血浆中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、丙酮、酪氨酸、1-甲基组氨酸等化合物含量较高,差异有统计学意义 (P <0.05)。【图1略】
3 讨论
支气管哮喘的病理生理过程多以气道高反应性、气道炎症及可逆性气道阻塞为主,其中气道炎症是气道阻塞、气道高反应性的病理基础。体液中的代谢物质与细胞、组织和整体水平的生物化学状态密切相关,内环境的任何变化都会导致体液中代谢物质发生变化,进而在血液等体液的代谢型中得到表现。
研究表明,肾虚与神经内分泌紧密相关,与神经损伤存在一定的相关性,肾素、血管紧张素及醛固酮水平与肾阴虚证相关,肾阳虚多与能量利用异常相关。本研究发现肾虚痰瘀型哮喘组血浆中1-甲基组氨酸、酪氨酸、葡萄糖、乳酸、丙酮降低,丙酮酸、甘氨酸升高;1-甲基组氨酸去甲基生成组氨酸经组氨酸脱羧酶催化生成组胺,酪氨酸经酪氨酸羟化酶合成儿茶酚胺(多巴、去甲肾上腺素、肾上腺素);葡萄糖为糖酵解原料,中间产物丙酮酸、乳酸,丙酮由肝细胞线粒体生成释放入血,呼吸肌收缩一部分 能 量 由 糖 酵 解 供 应,另 一 部 分 来 源 于 脂 代谢,脂肪分解中间产物乙酰CoA对丙酮酸脱氢酶活性有抑制作用,抑制丙酮酸脱氢,促进乳酸脱氢变成丙酮酸;甘氨酸、精氨酸经脒基转移酶合成胍乙酸,胍乙酸经甲基转移酶生成肌酸,肌酸为能量储存与利用的重要化合物。故推测肾虚痰瘀型哮喘患者为肾阴阳俱虚,机体处于能量利用异常,主要表现为糖代谢及脂代谢方面,血浆中葡萄糖、乳酸、丙酮含量降低与丙酮酸、甘氨酸升高可能是肾虚的生物学标志 物。痰 淤 证 与 免 疫 炎 症 介 质 存 在 密 切 的 关联,“痰可挟瘀”、“瘀可致痰”,痰、瘀两者相互交结,形成痰瘀交阻,痰证、瘀证、痰瘀交阻证统视为“痰瘀证”;本研究发现肾虚痰瘀证支气管哮喘患者血浆中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸含量降低。
亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸同时具有能量、糖异生底物及肌蛋白代谢调节作用,参与持续病理消耗状态下供能及蛋白质合成和分解,调节机体免疫功能,提高运动能力;苏氨酸参与必须营养氨基酸与糖代谢、脂代谢、转氨基,与免疫蛋白的合成密切相关,推测痰瘀证血浆代谢组学的生物学标志物可能是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸和酪氨酸。
综上所述,肾虚痰瘀型哮喘患者的代谢表型、代谢网路、代谢产物发生改变,肾虚痰瘀证可能是其他型哮喘发展的终点,中医分型中也可能是最终表现形式,与本课题组既往研究结果一致。通过研究初步确定肾虚痰瘀证哮喘患者可能的生物学物质基础是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乳酸、丙氨酸、糖蛋白、丙酮、酪氨酸、1-甲基组氨酸降低,丙酮酸、甘氨酸升高。明确肾虚痰瘀证在微观生物学存在一定的物质基础,支气管哮喘中医存在一定再分性,中医支气管哮喘“同病异证”理论存在微观生物学物质基础,为今后哮喘中医证型肾虚痰瘀证的划分提供一定内在依据。
参考文献:
[1]钟南山.支气管哮喘-基础与临床[M].北京:人民卫生出版社,2006:1,8.
[2]Braun-Fahrlnder C,Gassner M,Grize L,et al.No furtherincrease in asthma,hay fever and atopic sensitisation in ado-lescents living in Switzerland[J].Eur Respir J,2004(23):407-413.
[3]陈萍,谢华,吴志家,等.辽宁省支气管哮喘流行病学调查[J].中华结核和呼吸杂志,2002(10):30-33.
[4]全国儿童哮喘防治协作组.中国城区儿童哮喘患病率调查[J].中华儿科杂志,2003(2):47-51.
[5]哈木拉提·吾甫尔,李风森,杨剑,等.西医重度哮喘、中医虚哮型哮喘和维医异常黑胆质哮喘的交互性研究[J].科技导报,2008,26(6):50-57.
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