脂肪肝论文第六篇：探讨复元活血汤对非酒精性脂肪肝病小鼠的保护作用
摘要：[目的]探讨复元活血汤对非酒精性脂肪肝病小鼠的保护作用。[方法]将36只C57 BL/6 J小鼠随机分为对照组、模型组和给药组，模型组和给药组小鼠以HFD高脂饲料喂养12周，对照组以普通饲料喂养。造模成功后，给药组小鼠进行灌胃复元活血汤(生药量为13.65 g·kg-1·d-1),给药8周，模型组和对照组灌胃等量0.9%氯化钠溶液。记录各组小鼠造模前后不同时期体质量，通过ELISA试剂盒检测各组小鼠灌胃8周时血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)含量，苏木精-伊红染色法观察各组小鼠肝组织病理变化，Western-blot检测各组小鼠肝组织单磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK蛋白表达水平。[结果]与对照组相比，模型组小鼠体质量显着升高(P<0.05),给药组给药6周、8周后小鼠体质量显着下降；模型组小鼠血清肝功能指标ALT和AST、脂质代谢指标TG和TC含量均显着升高(P<0.05),给药组各指标均显着下降(P<0.05);模型组小鼠肝组织AMPK、p-AMPK蛋白表达水平显着下降(P<0.05),给药组AMPK、p-AMPK蛋白表达水平显着均显着升高(P<0.05)。[结论]复元活血汤可改善非酒精性脂肪肝病，其机制可能与复元活血汤激活AMPK信号通路有关。
关键词:非酒精性脂肪肝病;复元活血汤; AMPK信号通路;
Abstract：[Objective]To explore the protective effect of Fuyuanhuoxue decoction on mice with nonalcoholic fatty liver disease.[Methods]Thirty-six C57 BL/6 J mice were randomly divided into control group, model group and administration group, for 12 weeks, mice in the model and drug groups were fed with HFD high-fat diets, the control group was fed with ordinary feed.After the model was developed, gavage feeding was performed daily in mice in the administration group(13.65 g·kg-1·d-1) for eight weeks, the same amount of normal saline was given to the model group and the control group.The mass of mice in each group was recorded, the serum ALT,AST,TG and TC of each group were detected by ELISA kit.HE staining method was used to observe the pathological changes of liver tissue.Western-blot was used for the detection of AMPK,p-AMPK protein expression in liver tissue of mice.[Results]The body mass of mice in the model group increased significantly(P<0.05),and the body mass decreased significantly after 6 weeks and 8 weeks of administration; the serum liver function index ALT and AST,lipid metabolism index TG and TC level of mice in the model group increased significantly(P<0.05).The expression level of AMPK,p-AMPK protein increased significantly after administration(P<0.05).[Conclusion]Fuyuanhuoxue decoction can improve nonalcoholic fatty liver disease, and its mechanism may be related to the activation AMPK signal pathway of Fuyuanhuoxue decoction.
非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是比较常见的临床病理综合征，是排除了酒精以及其他明确的能够导致肝脏损伤的因素外，出现的以肝实质脂肪细胞大量堆积以及脂肪变性为主要特征的疾病[1,2]。NAFLD主要的病理变化是肝脏出现脂肪代谢紊乱，肝细胞中三酰甘油(triglyceride, TG)水平异常升高、慢性炎症等[3]。研究发现脂质代谢功能紊乱、炎症反应可能在NAFLD发病过程中起着举足轻重的作用[4]。单磷酸腺苷激活蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)是机体调节糖脂代谢的重要蛋白激酶，有研究表明AMPK信号通路的激活通过肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)介导的脂肪酸摄取增加脂肪酸氧化，从而减少丙二酰辅酶A的生成。此外，AMPK的激活还可通过增加磷酸化和激活油棕乙酰CoA羧化酶(ACC)来降低脂肪酸合成，从而在NAFLD发病过程中起着重要作用[5]。复元活血汤来自《世医得效方》,具有活血化瘀、行气活血、抗凝止痛、清热消炎等功效[6],本研究以AMPK信号通路以及脂肪代谢为切入点，初步探讨复元活血汤对NAFLD小鼠的保护作用，并初步研究其作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级C57 BL/6 J健康小鼠36只，雄性15～17 g, 购自山东省实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0122;饲养于山东中医药大学动物房，室温(26±2)℃,可以自由饮食、饮水。
1.2 药物和试剂
复元活血汤：柴胡15 g, 天花粉9 g, 当归9 g, 红花6 g, 桃仁9 g, 酒大黄30 g, 炮甲片6 g(另煎),甘草6 g。上述中药材均购买于山东中医药大学附属医院，由体表面积法计算得到小鼠生药量为13.65 g·kg-1·d-1。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、TG、总胆固醇(total cholesterol, TC)ELISA试剂盒均购买于上海信帆生物科技有限公司；兔抗鼠AMPKα多克隆抗体、兔抗鼠p-AMPKα多克隆抗体及HRP标记山羊抗兔二抗均购买于美国cell signaling公司；BCA蛋白定量试剂盒、Western一抗及二抗稀释液、去除液、显影定影试剂盒均购买于美国Thermo-fisher公司。HFD高脂饲料由山东省实验动物中心提供，配方：蔗糖20%、猪油20%、胆固醇3%、基础饲料57%。
1.3 主要仪器
5804 R低温高速离心机购买于德国Eppendorf公司；TS-I生物组织自动脱水机、KD-BM石蜡包埋机、KD-3398全自动石蜡切片机购买于上海隆拓仪器设备厂；AT-2000 G全自动革兰染色仪购买于杭州九洋生物科技有限公司，Wes全自动蛋白质印迹定量分析仪购买于美国Protein Simple公司；DHG-9003电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、移液枪购买于上海姚氏仪器设备厂；BX-51 M光学显微镜购买于日本奥巴斯公司；E-Gel Imager凝胶成像系统购买于美国赛默飞公司。
1.4 实验动物模型复制、分组及给药方法
将36只C57 BL/6 J小鼠随机分为对照组、模型组和给药组，每组各12只，模型组和给药组小鼠以HFD高脂饲料喂养12周[7],对照组以普通基础饲料喂养。建模结束后将对照组、模型组和给药组每组任选2只小鼠，麻醉后取出右叶肝脏组织，HE染色法观察小鼠肝组织病理变化，对照组小鼠肝组织正常，无脂肪性病变；模型组和给药组出现脂肪肝病病理表现，即模型组和给药组小鼠均造模成功[7]。随后将给药组小鼠进行复元活血汤灌胃给药(生药量为13.65 g·kg-1·d-1),给药8周，模型组和对照组灌胃等量0.9%氯化钠溶液。
1.5 观察指标
1.5.1 小鼠体质量观察
建模前、造模后及给药后每2周对对照组、模型组和给药组小鼠称重，并记录其体质量。
1.5.2 小鼠血清ALT、AST、TG、TC含量变化检测
给药8周结束后，对照组、模型组和给药组小鼠均隔夜禁食不禁水，随后采用水合氯醛进行麻醉，分别摘取每只小鼠的眼球并取血液各0.8 ml, 按照4℃、3 000r/min的转速进行离心，离心时间为15 min, 分离血清，采用ELISA检测各组小鼠血清ALT、AST、TG、TC含量。
1.5.3 观察小鼠肝脏组织病理变化
将麻醉后的小鼠腹腔剪开，分离取出右叶肝脏组织，用体积百分比为4%的多聚甲醛固定，石蜡包理，5 μm厚连续切片，苏木精-伊红(HE)染色后光镜下观察肝脏组织病理形态变化。
1.5.4 Western-blot法检测小鼠肝脏组织中AMPK、p-AMPK蛋白表达
取200 mg小鼠肝脏组织，加上冰冷RIPA蛋白裂解液，制成肝脏组织匀浆，按照4℃、12 000r/min的转速进行离心，离心时间为15 min, 离心出总蛋白。加等体积的2×SDS上样缓冲液，在100℃温度中煮沸5 min使蛋白质变性。按照每孔50 μg进行加样，采用SDS/PAGE凝胶电泳法进行电泳，将其转移到PVDE膜，加5%BSA进行封闭处理3 h, 采用TBST进行洗膜，每次洗膜5 min, 连续洗膜3次；加入兔抗鼠一抗(稀释度1∶1 000),放置在4℃恒温环境中过夜，采用TBST进行洗膜，每次洗膜5 min, 连续洗膜3次；再加入稀释度为1∶10 000的二抗，放置在室温环境中，放置1 h, 采用TBST进行洗膜，每次洗膜5 min, 连续洗膜3次，进行显色，显色时间为1 min, 随后用蒸馏水进行洗涤，采集图像并保存，采用凝胶图像分析成像系统进行相关分析，将β-actin作为内参，AMPK、p-AMPK和β-actin面积光密度比值分别代表AMPK、p-AMPK蛋白表达情况。
1.6 统计学处理
采用SPSS20.0软件进行统计，多组计量资料的比较采用单因素方差分析，采用SNK-q检验进行两两之间的比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组小鼠实验前、后不同时期体质量比较
与对照组相比，模型组和给药组小鼠体质量在造模12周后显着升高(F=77.166,P<0.05);与模型组相比，给药组灌胃2周、4周后体质量无显着变化，灌胃6周、8周后小鼠体质量显着下降(LSD-t=5.022、LSD-t=10.918,P<0.05)。见表1。
2.2 各组小鼠灌胃8周后血清生化指标的比较
灌胃8周时，与对照组相比，模型组小鼠血清肝功能指标ALT和AST、脂质代谢指标TG和TC含量均显着升高；与模型组相比，给药组小鼠血清各指标均显着下降。各组小鼠灌胃8周后血清生化指标的比较见表2。
2.3 各组小鼠肝组织细胞结构比较
对照组小鼠肝组织细胞结构正常，无脂肪性病变；模型组小鼠肝组织出现脂肪空泡，细胞核被挤压，细胞结构紊乱；给药组小鼠肝组织脂肪空泡减少，细胞形态结构得到改善，见图1。
2.4 各组小鼠肝组织AMPK、p-AMPK蛋白表达水平的比较
与对照组相比，模型组小鼠肝组织AMPK、p-AMPK蛋白表达水平显着下降(P<0.05);与模型组相比，给药组AMPK、p-AMPK蛋白表达水平均显着升高(P<0.05),见图2。
表1 各组小鼠实验前、后不同时期体质量的比较 g,x?±s
与对照组比，1）P<0.05；与模型组比，2)P<0.05。
表2 各组小鼠灌胃8周后血清生化指标的比较 x?±s
与对照组比，1）P<0.05；与模型组比，2)P<0.05。
图1 各组小鼠肝组织细胞结构比较(n=10,×100)
图2 各组小鼠肝组织AMPK、p-AMPK蛋白表达水平的比较(n=3)
与对照组比，1)P<0.05;与模型组比，2)P<0.05
3 讨论
近年来NAFLD的发病率呈逐年上升趋势，NAFLD肝脏脂肪细胞过度堆积、炎症有着紧密的关联[8],肝脏脂肪细胞过度堆积导致肝细胞出现氧化应激反应以及炎症反应是导致NAFLD患者肝脏功能损伤、肝细胞病变以及肝脏脂肪代谢紊乱的重要影响因素[9]。复元活血汤配方中包括柴胡、天花粉、当归、红花、桃仁、酒大黄、炮甲片、甘草，具有活血化瘀、行气活血、抗凝止痛、清热消炎等功效，目前复元活血汤广泛应用于跌打损伤、骨折中且具有显着疗效[10,11],另有研究发现其在原发性肝癌的治疗中疗效较好[12],动物实验发现复元活血汤能有效地改善肝脏微循环，具有防治实验大鼠肝纤维化、保护肝细胞、恢复肝功能的作用[13]。但其在NAFLD中的作用及其作用机制尚不明确，为此本研究进行了相关探讨。
本研究对模型组和给药组小鼠以HFD高脂饲料喂养12周，发现与对照组相比，模型组和给药组小鼠体质量在造模12周后显着升高，模型组小鼠血清肝功能指标ALT和AST、脂质代谢指标TG和TC含量均显着升高，且肝组织出现脂肪空泡，细胞核被挤压，细胞结构紊乱，提示模型复制成功，高脂饮食可以导致NAFLD的发生，这与国内外许多研究[14,15,16]的结果一致。而给药组小鼠每日进行复元活血汤灌胃给药，6周、8周后小鼠体质量显着下降；与模型组相比，给药组小鼠血清ALT和AST、脂质代谢指标TG和TC含量均显着下降，给药后小鼠肝组织脂肪空泡减少，细胞形态结构得到改善。提示复元活血汤可以降低NAFLD模型小鼠体质量，改善肝功能水平，降低血脂水平，缓解NAFLD的病情进展。
AMPK在NAFLD发病过程中具有重要的作用，其活化后可以降低脂肪合成相关基因的表达水平，还可以提高脂肪代谢基因表达水平，从而促进脂肪代谢，减少肝脏组织中脂肪细胞的大量过度堆积[17,18,19]。动物实验研究发现，采用高脂肪饮食形成的NAFLD动物模型，出现了AMPK磷酸化水平和活性降低的现象，进一步提示AMPK及其活性的改变在NAFLD发病过程中具有重要的作用[7]。AMPK已经成为研发NAFLD治疗药物的重要作用靶点。p-AMPK是AMPK的活化形式，可导致下游脂肪合成相关蛋白激酶及其靶基因表达水平降低，改善肝脏脂肪代谢功能，减少肝脏脂肪酸的生产合成，降低脂肪堆积，逆转肝脏组织中脂肪细胞过度堆积[20]。本研究发现，与对照组相比，模型组小鼠肝组织AMPK、p-AMPK蛋白表达水平显着下降；与模型组相比，给药组AMPK、p-AMPK蛋白表达水平均显着升高。表明复元活血汤可通过激活AMPK信号通路发挥缓解NAFLD的病情进展的作用，其具体作用机制可能是复元活血汤激活AMPK信号通路，促进ATP的分解代谢，抑制细胞发育繁殖以及生物合成等所需ATP的消耗[21]。而关于复元活血汤的具体作用机制需进一步深入研究。
综上所述，复元活血汤能够改善NAFLD,其机制可能与复元活血汤激活AMPK信号通路有关。
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