微量元素在重度烧伤患者创面肉芽组织中的亚细胞分布

　　引言

　　微量元素是构成生物体细胞或体液的重要生理组成成分,在生物体内含量极低,对于维持生物体的生长、代谢、遗传以及能量转换担当着特殊使命,在生物体的生命活动和生理过程中必不可少,微量元素的缺乏会引起生物体的生理紊乱,导致生理功能异常或病变,引发疾病。

　　目前,生物体内微量元素的研究在微生物学和植物学等领域较为活跃,而在在医学中的研究却相对较少。由于生物体内各微量元素平衡调控的分子机制异常复杂,集中于某一种或几种微量元素的含量及形态在疾病中单一作用的研究难以系统诠释其生物功能,须进一步加强生物体的亚细胞结构、大分子蛋白和核酸中微量元素的研究。重度烧伤患者由于伤后生命特征处于一种应激状态,其体内的微量元素也会产生一些异常现象,相应地会引起某些生物酶的生物活性发生变化,国内外已有大量学者对此展开研究,但有关烧伤创面肉芽组织中微量元素的亚细胞分布研究尚未见报道。

　　本工作利用八极杆碰撞反应池(ORS)技术的电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法研究了Cr,Mn,Fe,Co,Cu,Zn,Se,Cd等元素在重度烧伤患者创面肉芽组织中的亚细胞分布,以期从亚细胞层面获得八种微量元素在重度烧伤患者创面肉芽组织中的变化规律。

　　1、实验部分

　　1.1仪器与工作参数

　　7500cx电感耦合等离子体质谱仪(美国Agilent公司)。调谐后仪器工作参数为:功率1500W,等离子气流量15.0L·min-1,辅助气流速1.00L·min-1,氦气流量5.2mL·min-1,氢气流速5.8mL·min-1,采样深度8.0mm,重复采样3次。
BeckmanL100XP超速离心机(美国Beckman公司)。Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。CEMMARSX高通量密闭微波消解系统(美国培安公司)。

　　1.2试剂与标准溶液

　　混合标准溶液:由Cr,Mn,Fe,Co,Cu,Zn,Se,Cd的单元素标准溶液(1000μg·mL-1,购自国家标准物质研究中心)配制而成。

　　内标溶液:1.0μg·mL-1,由相应的Rh单元素储备溶液(1000mg·L-1,购自国家标准物质研究中心)配制而成。硝酸、双氧水、乙酸、乙酸铵均为优级纯(德国Merck)。实验用水为电阻率≥18.2MΩ·cm超纯水,所有器皿工具均用20%(φ)HNO3浸泡过夜,用超纯水冲洗5次,备用。

　　1.3样品

　　实验所用创面肉芽组织标本和正常人体皮肤组织标本均取自湖南省常德市第一人民医院烧伤科在院患者,标本采集得到了患者本人及家属的知情同意。所取创面肉芽组织标本均为伤后4—5周共40例,正常皮肤组织标本40例,其中男女性别比例均为1∶1。所有重度烧伤患者入院前均身体健康,无职业金属元素接触史,且伤后均未进行微量元素补给治疗。取样过程中避免金属元素污染,所取样品用纱布吸干组织标本渗液后均冻存于-70℃下待用。

　　1.4亚细胞

　　组分分离取10~30g组织标本样品,除去纤维和结缔组织,用10mmol·L-1的乙酸铵缓冲液(pH7.4)洗涤5次后,加入三倍体积的乙酸铵缓冲液于匀浆器中匀浆,采用差速离心法获得细胞核、线粒体、溶酶体、微粒体和细胞上清液等亚细胞组分。整个分离过程均在4℃以下操作进行,所得组分冷冻干燥处理后冻存于-20℃下保存待用。

　　1.5方法

　　准确称取0.5000g亚细胞组分样品于微波消解罐内,加入4mL双氧水和1mL硝酸,密闭后放入微波消解系统内消解。微波消解程序参见文献。消解完成后冷却,用超纯水转移至50mL聚丙烯容量瓶中定容,同时做试剂空白。

　　2、结果与讨论

　　2.1空白值分析

　　由于试剂空白可能对实验测定带来不同程度的本底污染,首先对实验用超纯水、2%硝酸(φ)、8%双氧水(φ)、10mmol·L-1的乙酸铵缓冲溶液上机测试,记录待测元素的计数值(CPS)值,以了解仪器背景以及试剂空白所带入的空白和本底污染对分析结果的影响程度,结果见表1。实验用超纯水和8%双氧水(φ)中的CPS值很小,本底值极低,可以忽略;而2%硝酸和10mmol·L-1乙酸铵缓冲溶液的CPS值略有偏高,表明会给实验带来轻微的本底污染,但相对于样品中待测元素的CPS值,试剂空白的影响甚微,可以忽略不计。

　　2.2干扰校正及检出限

　　样品基质主要组成元素为C,Ca,Cl,P,K,Na,S,且8个待测元素均属于中质量元素,存在不同程度的质谱干扰,尤其是Cr,Fe,Zn,Se等元素的质谱干扰非常严重,校正质谱干扰最直接有效的方法是采用碰撞/反应池技术。实验首先通过同位素的选择避开大量干扰,然后采用ORS技术进行校正。53Cr,55Mn,56Fe,59Co,63Cu,66Zn选择He碰撞测定模式,78Se选择H2反应测定模式,而111Cd质谱干扰轻微,选择普通测定模式(见表2)。

　　实验采用试剂空白溶液连续测定11次,计算各待测元素所对应计数值的标准偏差,取标准偏差3倍所对应的标准曲线上的浓度值为检出限,表2显示,各待测同位素的检出限在0.72~33.05ng·L-1之间,完全满足本实验分析要求。

　　2.3方法的准确度和精密度

　　采用国家一级标准参考物质鸡肉(GBW10018)考察方法的准确度和精密度,按所选实验条件和操作步骤直接测定鸡肉中8个待测元素的含量,重复测定11次,结果见表3。8个待测元素的测定值与物质提供的参考值基本一致,相对标准偏差在之间1.8%~8.3%之间,证实了方法具有良好的准确度和精密度。

　　2.4样品分析

　　应用上述方法对重度烧伤患者创面肉芽组织和正常人体皮肤组织样品进行分析,研究了Cr,Mn,Fe,Co,Cu,Zn,Se,Cd等元素在细胞核、线粒体、溶酶体、微粒体、细胞上清液等亚细胞组分中的分布情况。表4结果表明,各元素在亚细胞组分中均呈非均匀分布,存在较大差异。采用t检验进行统计比较,发现有部分元素在正常组织和创面肉芽组织之间无明显差异,如Co在创面肉芽组织和正常组织的亚细胞分布中不存在显著性差异。

　　在创面肉芽组织和正常皮肤组织的细胞核中,Cu在创面肉芽组织中的含量明显高于正常皮肤组织(p<0.05),Cr,Mn,Zn,Se,Cd则明显低于正常皮肤组织细胞核中的含量(p<0.05,p<0.01,p<0.01,p<0.05,p<0.05),6个元素在细胞核中的含量均具有显著性差异,元素Fe无显著性差异;在创面肉芽组织和正常组织的线粒体中,Cr,Mn,Zn,Se的含量则明显低于正常皮肤组织(p<0.01,p<0.001,p<0.001,p<0.05);在创面肉芽组织溶酶体中,Cr,Zn,Se,Cd的含量则明显低于正常皮肤组织溶酶体中的含量(p<0.001,p<0.001,p<0.01,p<0.05),其余元素的含量无显著性差异;在创面肉芽组织微粒体中,Mn,Fe,Zn的含量明显低于正常皮肤组织(p<0.01,p<0.01,p<0.001);在创面肉芽组织和正常组织的细胞上清液中,Cu在创面肉芽组织中的含量明显高于正常皮肤组织(p<0.05),Cr,Zn,Se的含量则明显低于正常皮肤组织(p<0.05,p<0.01,p<0.05),其余元素的含量无显著性差异。

　　由于各种微量元素在细胞代谢中发挥重要作用,细胞内各种元素浓度的相对稳定对于细胞正常的生理活动而言是至关重要的。重度烧伤患者创面肉芽组织中Cr,Mn,Fe,Co,Cu,Zn,Se,Cd等8个元素在亚细胞中的分布除Co和Cu以外,均低于正常皮肤组织。

　　Cr作为葡萄糖耐量因子的重要组成元素,能促进胰岛素与组织受体的反应,Cr影响和干扰酶系统的活动并参与体内蛋白质的代谢过程;Mn在细胞生命活动中起着重要作用,是丙酮酸脱羧酶的有效组成元素,人体中许多酶系统均由Mn激活,Mn在重度烧伤患者创面肉芽组织中的减少会直接影响烧伤创伤面的愈合;铁是免疫反应的关键性辅助因子,缺铁会导致巨噬细胞的吞噬功能减弱,造成机体免疫机制受损,淋巴细胞内DNA合成障碍,抗体的产生受抑制,白细胞功能障碍和T淋巴细胞功能明显受损,易致感染;Zn是人体多种酶的必需成分,可以强烈影响免疫系统,能与活化的代谢产物结合,增加其排出,缺Zn导致组织细胞老化,机体的防御能力显著降低;Se通过谷胱甘肽过氧化物酶清除自由基,避免过氧化物对细胞膜、微粒体膜及溶酶体膜上的脂质产生破坏性氧化作用,从而保护细胞膜的完整性、不变性及细胞的正常生理功能;Cd可以诱导许多基因的异常表达,而这些基因的异常表达与细胞的正常活动有着密切的联系,但具体的机制有待于进一步研究。

　　3、结论

　　采用电感耦合等离子体质谱法研究了重度烧伤患者创面肉芽组织及正常皮肤组织中Cr,Mn,Fe,Co,Cu,Zn,Se,Cd等8个微量元素在细胞核、线粒体、溶酶体、微粒体和细胞上清液等亚细胞组分中的分布。各元素在亚细胞组分中均呈非均匀分布,存在较大差异。采用t检验进行统计比较,发现有部分元素在正常组织和创面肉芽组织之间无明显差异,除元素Co以外,其他所有元素在重度烧伤患者创面肉芽组织和正常组织的亚细胞分布中均存在显著性差异。