急性胰腺炎( acute pancreatitis,AP) 是一种常见的急腹症,分为轻症急性胰腺炎( mild acute pancre-atitis,MAP) 和重症急性胰腺炎( severe acute pancre-atitis,SAP) 。其中轻症急性胰腺炎症状较轻,预后较好,死亡率低。而重症急性胰腺炎由于炎症扩大作用,常引起全身炎症反应综合征( systemic inflam-matory reactive syndrome,SIRS) ,危及到机体多个器官,病情凶险,进展迅速,病死率极高。其中急性肺损伤( acute lung injury,ALI) 是重症急性胰腺炎常见的并发症之一,也是患者早期死亡的主要原因,其发病机制尚未阐明,所以目前仍无有效的特异性的治疗方法。而近年来研究显示 p38MAPK 信号转导通路是重症急性胰腺炎并发急性肺损伤的重要机制,所以本文通过实验研究探讨分析 p38MAPK抑制剂对重症胰腺炎大鼠急性肺损伤的保护作用,现将结果报道如下。
1、 资料与方法
1. 1 一般资料 选购哈尔滨医科大学动物实验中心雄性健康 SPF 级 Sprague-Dawley 大鼠 60 只,体重200 ~ 250 g,平均体重( 220 ± 20) g。所有动物于实验前 12 h 禁食,不禁水,饲养环境为标准明暗周期。
实验试剂主要有牛磺胆酸钠,p38MAPK 抑制剂SB203580,均由美国 Sigma 公司提供。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 动物分组及模型建立 采用随机数字表法将 60 只健康成年的雄性 SD 大鼠分为三组,A 组为假手术组,B 组为重症胰腺炎模型组,C 组为重症胰腺炎模型加 p38MAPK 抑制剂 SB203580 组。A 组动物开腹后进行胰胆管注射生理盐水,并将十二指肠和胰腺进行翻动。B 组动物开腹后进行胰胆管逆行穿刺注射 5% 牛磺胆酸钠,建立重症急性胰腺炎模型。C 组动物在进行造模前 1 h 向所有动物体内注射 p38MAPK 抑制剂 SB203580,剂量为 1 mL·kg- 1体重,然后同 B 组动物建立重症急性胰腺炎模型。
1. 2. 2 检测方法 分别于模型建立后 0. 5、6、12 h取动物的肺脏组织进行观察指标的检测。取肺组织进行 HE 染色切片制作( 全部动物均未死亡,取材于动物麻醉下实施) ,光学显微镜下观察肺组织病变,并根据 Hofbaue 法以肺实质组织和空肺泡面积百分比对肺损伤进行病理学评分。取固定量肺组织先称量出组织的湿重,然后将组织置于烤箱中烘烤后,称量组织的干重,计算出肺组织湿干重比。
采用紫外分光光度计检测肺组织髓过氧化物酶( MPO) 的活性。采用 RT-PCR 法检测肺组织中p38MAPK mRNA 的表达水平,GAPDH 和 p38MAPK上下游引物序列如下: GAPDH: F: 5’-TGAAGGTCG-GTGTCAACGGATTTGCC-3 ’,R: 5 ’-CATGTAGGC-CATGAGGTCCACCAC-3 ’,产 物 长 度 为 999bp。p38MAPK: F: 5 ’-GTGTCGGTGATGTCAGATGG-3 ’,R: 5’-CAGTATGCAGTCCAGCTCCA-3’,产物长度为687bp。
1. 3 统计学方法 应用 SPSS 19. 0 软件进行数据分析。观测资料主要是计量数据,采用均数 ± 标准差( x ± s) 表示。多组间的比较为单因素方差分析,两两组间的比较为成组 t 检验。总显著性水准α =0. 05。
2、 结果
2. 1 大鼠肺组织损伤病理学检查 三组大鼠肺组织损伤病理学评分结果见表 1,得出随着时间的推移 B 组和 C 组大鼠肺组织损伤病理评分均逐渐升高,P < 0. 05,差异具有统计学意义; 同时 B 组与 A组相比,大鼠肺组织损伤病理评分于三个时间点都显著升高,P <0. 05,差异具有统计学意义; 而 C 组与 B 组相比,大鼠肺组织损伤病理评分于三个时间点有所降低,P <0. 05,差异具有统计学意义。病理变化见图 1 ~3。
2. 2 大鼠肺组织湿干重检测 三组大鼠肺组织湿干重比较结果见表 2,得出随着时间的推移 B 组大鼠肺组织湿干重比逐渐升高,P <0. 05,差异具有统计学意义; 同时得出 B 组大鼠肺组织湿干重比于三个时间点都显著升高于 A 组,P <0. 05,差异具有统计学意义; 而 C 组大鼠肺组织湿干重比于三个时间点都低于 B 组,P <0. 05,差异具有统计学意义。
2. 3 大鼠肺组织髓过氧化物酶( MPO) 活性检测三组大鼠肺组织髓过氧化物酶( MPO) 活性检测结果见表 3,得出随着时间推移 A 组、B 组及 C 组大鼠肺组织髓过氧化物酶( MPO) 活性逐渐升高,P <0. 05,差异具有统计学意义; 同时得出 B 组大鼠肺组织髓过氧化物酶( MPO) 活性于三个时间点都显著升高于 A 组,P < 0. 05,差异具有统计学意义; 而C 组大鼠肺组织髓过氧化物酶( MPO) 活性于三个时间点都低于 B 组,P < 0. 05,差异具有统计学意义。
2. 4 大鼠肺组织 p38MAPK mRNA 的表达水平检测 三组大鼠肺组织 p38MAPK mRNA 的表达水平检测结果见表 4,得出随着时间推移 A 组、B 组及 C组大鼠肺组织 p38MAPK mRNA 的表达水平呈现先上升再下降的变化趋势,P <0. 05,差异具有统计学意义; 同时得出 B 组大鼠肺组织 p38MAPK mRNA的表达水平于三个时间点都显著升高于 A 组,P <0. 05,差异具有统计学意义; 而 C 组大鼠肺组织p38MAPK mRNA 的表达水平于三个时间点都低于 B组,P <0.05,差异具有统计学意义。见图4 和图5。
3、 讨论
随着我国生活水平不断提高,人们的饮食习惯和结构发生了很大变化,也由此导致急性胰腺炎的发生率呈不断上升的趋势。急性胰腺炎中有约10% 左右的患者为重症急性胰腺炎,其病情凶险,病死率较高,已严重威胁到患者的生命健康。
重症急性胰腺炎的发展与患者全身的炎症反应密切相关。研究显示重症急性胰腺炎患者病程之所以进展迅速主要是由于患者体内的炎症介质被激活,并不断激活和扩增其他炎症介质,导致炎症反应被放大化,引起全身炎症反应综合征( SIRS)。而 SIRS 又是引起急性肺损伤以及全身多器官功能损伤的主要原因。所以对于控制重症急性胰腺炎的一个重要方向即是抑制体内的炎症反应。而目前所了解到的炎症介质已有 30 多种,其中肿瘤坏死因子 TNF-α 被认为是主要作用因子,尤其对于早期炎症的发生起到重要作用。TNF-α主要是由被激活的巨噬细胞产生,国内外有报道显示 TNF-α 的基因表达在急性重症胰腺炎大鼠模型中随着肺损伤程度的增加,其表达水平不断升高,说明 TNF-α 是重症急性胰腺炎并发急性肺损伤的重要因素。而机体对于 TNF-α 的调控,主要是通过 p38MAPK 信号转导通路进行调节的,研究表明p38MAPK 调节着 TNF-α 的转录和翻译过程,直接影响着 TNF-α 的合成水平。
p38MAPK 是一种细胞内丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶,是一类重要的信号转导酶,通过将细胞外信号转导至细胞核内,从而调控着基因的转录与翻译过程。p38MAPK 尤其在机体的应激和炎症反应中具有重要的调控作用,其被磷酸化激活后,可导致细胞释放大量的炎性因子,并使之不断产生,从而导致机体炎症反应调控失衡,引起了炎症的级联瀑布效应。随着研究不断深入,现已证实可将p38MAPK 信号转导通路作为重症急性胰腺炎并发急性肺损伤时的治疗靶点,所以 p38MAPK 抑制剂成为治疗的重要方向。
SB203580 即是一种 p38MAPK 抑制剂,属于吡啶异咪达唑类化合物,可在体内结合 p38MAPK 的非活化形式,同时与 ATP 的活性位点 T106 相结合,从而降低 p38MAPK 与 ATP 的结合能力,可阻断炎症反应时 p38MAPK 对巨噬细胞释放 TNF-α 的调控,从而降低了炎症反应的发生。本文通过大鼠实验,研究发现经过重症急性胰腺炎造模后的大鼠与正常大鼠相比,其肺组织损伤病理评分、肺组织湿干重比、肺组织髓过氧化物酶( MPO) 活性以及肺组织 p38MAPK mRNA 的表达水平均显著升高,而给予 SB203580 的大鼠与重症急性胰腺炎的大鼠相比上述指标均有所下降,P < 0. 05,说明 SB203580对炎症起到了抑制作用。
综上所述,p38MAPK 抑制剂能减少 TNF-α 的释放,降低炎症反应,为临床上治疗重症急性胰腺炎并发急性肺损伤的提供新的方向。
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