探讨乳腺癌干细胞的表型特征和生物学特性

　　乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，也是女性病死率最高的肿瘤，占女性恶性肿瘤死亡人数的 14%。乳腺癌干细胞的存在使乳腺癌难以治愈。乳腺癌干细胞除具有癌细胞的特征外，还具有普通干细胞所具有的特征，如自我更新、多向分化、增生潜能等，并且具有高致瘤性、转移性、耐药性等特点。因此，探讨乳腺癌干细胞的表型特征和生物学特性，在此基础上建立针对乳腺癌干细胞的治疗技术和策略，对乳腺癌的治疗具有重要意义。

　　1 乳腺癌干细胞的表面分子标记

　　不同的肿瘤干细胞具有不同的表面分子标记，根据这些表面分子标记可以进行肿瘤干细胞的分选。乳腺癌干细胞的主要表面分子标记如下。
　　1． 1 CD44+CD24－ / lowCD44+CD24－ / low是目前乳腺癌干细胞公认的表面标记分子。2003 年 Al-Hajj 等用流式细胞仪首次从乳腺组织中分离出具有该特殊表面标志的细胞，将 100 个 CD44+CD24－ / low细胞注入非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺小鼠( nonobese diabetic/severe combined immu-nodeficient，NOD / SCID) 体内，即可生成肿瘤。将小鼠体内生成的这些肿瘤细胞分离后再接种到小鼠乳房脂肪垫中，发现仍然可继续成瘤，其致瘤活性增加 10 ～ 50 倍。生成的肿瘤细胞经分离传代，发现其自我更新能力及成瘤能力均不变，而且新生成的肿瘤细胞与原发灶中细胞表型一致，同时也含有其他混合表型的非致瘤细胞。这充分表明含有CD44+CD24－ / low表型的乳腺癌细胞具有肿瘤干细胞特征。
　　1． 2 CD133+2008 年，Wright 等分离出 CD133+细胞，将 50 ～100 个 CD133+细胞接种于 NOD/SCID 小鼠体内，可快速生成肿瘤。然而，将经过不断传代的这群细胞接种于NOD /SCID 小鼠体内，发现随着传代次数的增加，其在 NOD /SCID 小鼠体内肿瘤形成率及生长速度均降低。这是关于CD133+作为乳腺癌干细胞表面标记分子的首次报道。
　　1． 3 CD55+有研究者利用流式细胞术从人乳腺癌细胞系 MCF-7 中分离出 CD55high细胞和 CD55low细胞，发现CD55high细胞具有更高的克隆形成效率、更强的凋亡抵抗性及一定的分化能力，因此推测 CD55 可能是乳腺癌干细胞一种新的表面标志，但还需体内成瘤实验验证其可靠性。
　　1． 4 整合素 α6 ( integrin-α6，ITGα6) Pontier 等从人类乳腺癌细胞 MCF-7 中分离出 ITGα6 过表达的细胞亚群，注入 1 000 个该细胞于免疫缺陷小鼠体内即可使小鼠生成肿瘤，并且具有很强的自我更新能力。而沉默 ITGα6 基因后，肿瘤生长速度明显缓慢。提示 ITGα6 可作为识别该亚群乳腺癌干细胞的标志。
　　1． 5 CD29highCD61+CD29 和 CD61 是与细胞生长相关的两种表面蛋白。CD29low在未分化成熟的乳腺上皮细胞CD24+中占管腔的大部分，CD29highCD24+可作为乳腺癌干细胞。有研究将 CD29lowCD24+未分化成熟的乳腺上皮细胞分为 CD61+干细胞和 CD61－成熟细胞两个亚群。在MMTV-Wnt1 乳腺癌的小鼠模型中，CD61+乳腺癌干细胞的成瘤能力远远高于 CD61－细胞的成瘤能力。

　　2 乳腺癌干细胞的分离

　　分离乳腺癌干细胞是探讨乳腺癌干细胞特性的重要切入点，目前分离乳腺癌干细胞最常用的方法有如下几种。
　　2． 1 利用细胞表面分子标记分选 来源于不同组织及种系的肿瘤细胞具有不同的肿瘤干细胞表面分子标记，其原理是用荧光标记的抗体孵育细胞，抗体特异性结合到表型标记后，在流式细胞仪系统检测下将标有荧光的细胞分选出来。Croker 等应用此法从人乳腺癌细胞系 MDA-MB-435、MDA-MB-231、MDA-MB-468 及 MCF-7 中分离出具有 CD44+CD24－ / low表型的乳腺癌干细胞。由于该方法具有较高的特异性，多数学者现已选用该法分选乳腺癌干细胞。
　　2． 2 染料外排法分选 肿瘤干细胞中特有 ATP 结合转运蛋白 2( ABCG2/Bcrpl) 能将 Hoechst33342、罗丹明 123 等染料从细胞内泵出，使已经染色的干细胞变为淡染状态。利用这一特性通过流式细胞仪可将其分选出来，所分选出来的细胞称为侧群细胞( side population，SP) 。SP 细胞分选技术作为研究乳腺癌干细胞的一种有效方法目前已被广泛使用。然而，SP 细胞分选还存在一些不足。首先，SP 细胞分选所用荧光染料 Hoechst33342 具有细胞毒性，可导致细胞在体外不能增殖及体内不能致瘤，因此无法精确比较所分选出来的SP 细胞和非 SP 细胞的差异。此外，SP 细胞不能完全体现干细胞的特性。
　　2． 3 倍比稀释和克隆形成 用于检测单个肿瘤细胞的增殖能力多采用倍比稀释法。在体外使用不同浓度的稀释液稀释细胞群，由于肿瘤干细胞具有自我更新的能力，因而可使被稀释的细胞群在体外不断增殖形成细胞克隆，然后鉴定不同细胞群克隆形成能力( colony forming efficiency，CFE) 。通常，体外克隆形成能力与异种移植体内成瘤能力一致。
　　2． 4 标记滞留细胞 在细胞培养过程中加入溴脱氧尿嘧啶核苷( BrdU) ，通过化学染色，将整合到细胞 DNA 中的 BrdU进行标记。BrdU 通过竞争可替代 DNA 合成期细胞核酸序列中的胸腺嘧啶核苷。细胞若迅速分裂，BrdU 就会因被稀释而无法测及; 若缓慢分裂，BrdU 可被检测。因此，本方法可用来鉴别和定位肿瘤干细胞。有学者利用 BrdU 标记小鼠乳腺细胞，发现滞留细胞具备干细胞特征，且细胞不断增殖。虽然，乳腺癌干细胞不断增殖，但并不是所有的干细胞都具有滞留细胞。因此，该方法存在局限性。
　　2． 5 醛脱氢酶活性测定分选 醛脱氢酶活性测定分选是基于醛脱氢酶( aldehyde dehydrogenase，ALDH) 的活性，ALDH高水平表达的细胞能被荧光标记，然后通过流式细胞仪进行鉴定、分选。ALDH 在正常组织干细胞及乳腺癌干细胞中高表达。Ginestier 等证实从正常和癌变的乳腺组织中可分离出高表达 ALDH 的乳腺癌干细胞，并对分选出的乳腺癌干细胞能否在 NOD/SCID 小鼠中形成肿瘤进行实验。结果证实，ALDH+细胞具有极高的成瘤性，仅 20 个细胞就可成瘤，相反 5 ×104个 ALDH－细胞也不能形成肿瘤。
　　2． 6 细胞芯片技术分选 细胞芯片技术是以活细胞作为研究对象的一种生物芯片技术。利用抗原与抗体、受体与配体和特异的蛋白间相互结合的原理，捕获所需目标细胞，而未结合的细胞则被冲洗掉。该技术的优点在于可直接对目标基因或细胞进行研究，具有较高的特异性; 由于芯片的密度较高，可同时对多份细胞样品进行信息量检测; 此外，还可高效、快速、准确地分离和鉴定目标基因或细胞，现已广泛用于干细胞的分离及肿瘤细胞的研究等各方面。然而，受技术成本高的限制，该技术目前在国内尚不能普及和推广。
　　2． 7 激光显微切割技术获取 激光显微切割技术是一种样本微分离的新技术，可分离单个活细胞。其原理是在显微镜下用激光对目的细胞进行无接触显微切割和分离，保证样品无污染、精度高( 切割精度可达1 μm) ，避免非目的细胞造成干扰。利用此方法可完成对单细胞的切割，切割样品准确性高、误差小，且分离出的细胞活性较高。

　　3 乳腺癌干细胞的鉴定

    经各种方法分选出来的细胞是不是乳腺癌干细胞还需进一步鉴定，目前多围绕乳腺癌干细胞的三大特性( 自我更新、分化潜能及成瘤能力) 进行功能鉴定，主要有体外细胞培养法( 微球体培养法) 和体内动物模型法。
　　3． 1 体外细胞培养鉴定( 微球体培养法) 微球体培养法是基于干细胞能在无血清培养液中悬浮生长并形成微球体的特性，已被广泛应用于干细胞的鉴定和富集。研究发现从人乳腺癌细胞系 MCF-7 中应用微球体培养法可成功地富集含 CD44+CD24－ / low表型的乳腺癌干细胞，使用该方法富集含 CD44+CD24－ / low表型的乳腺癌干细胞含量为普通单层培养法富集的5 倍。Ponti 等研究证实用微球体培养法从原代人乳腺癌细胞和 MCF-7 细胞株中富集的 CD44+CD24－ / low细胞，可悬浮生长形成微球体，并且可在体外连续扩增传代，具有自我更新能力，后将这些悬浮生长的微球体注入小鼠体内，发现其可使老鼠形成肿瘤。然而，该方法不能长期维持干细胞特性，经多次传代后的干细胞与体内的干细胞特性可能存在差异。因此，为长时间研究乳腺癌干细胞的特性，还需寻求更好的方法。
　　3． 2 体内动物模型鉴定 体内动物模型鉴定是指将所分选出来的含乳腺癌干细胞分子标记的亚群细胞接种于动物体内，观察他们的成瘤能力，从而验证目的细胞。研究发现将含 CD44+CD24－ / low表型的乳腺癌干细胞亚群接种于 NOD/SCID 小鼠体内后，即使很少量的细胞也可以形成肿瘤，而且小鼠体内所形成的肿瘤细胞与接种的肿瘤细胞表型一致。乳腺癌细胞亚群即使大量接种也难以形成肿瘤，从而验证了含 CD44+CD24－ / low表型的乳腺癌干细胞存在。目前鉴定乳腺癌干细胞的经典方法即动物实验。

　　4 基于乳腺癌干细胞的治疗

　　传统的放、化疗不易杀死乳腺癌干细胞，使其残存下来，易引起肿瘤复发或转移。在乳腺癌的治疗中，只有靶向消除、完全杀灭乳腺癌干细胞才是彻底治愈乳腺癌的关键。
　　4． 1 诱导分化治疗 诱导乳腺癌干细胞相关基因表型发生变化，使其分化成非乳腺癌干细胞，从而改变其生物学特性，为乳腺癌的治疗提供新策略。2011 年，Van Phuc 等利用ＲNA 干扰技术使 CD44 表达水平下调，CD44 下调可引起乳腺癌干细胞对阿霉素的敏感性增强。此外，有研究者利用基因敲除技术敲除 CD44，进行体内成瘤实验，将 CD44 基因敲除后，发现乳腺癌干细胞致瘤能力明显降低，细胞周期及干细胞相关基因表达水平发生改变，乳腺癌干细胞分化成非乳腺癌干细胞，增强其对放、化疗的敏感性。近来，有研究显示对乙酰氨基酚、雌激素可以通过诱导乳腺癌干细胞分化来辅助治疗乳腺癌。另外，Li 等也证实全反式维甲酸诱导乳腺癌干细胞分化可降低乳腺癌干细胞中CD44+CD24－ / low表达含量降低，从而预防乳腺癌复发。上述研究结果的发现为乳腺癌治疗提供新思路。
　　4． 2 溶瘤病毒治疗 溶瘤病毒，即肿瘤细胞特异性增殖病毒，是指能选择性感染肿瘤细胞，并能在肿瘤细胞中复制扩增，最终导致肿瘤细胞裂解和死亡的一类病毒。由于在其控制病毒复制的基因前插入了肿瘤特异性启动子，因此在正常细胞内无法复制，对正常细胞没有破坏或影响较小。目前，溶瘤病毒研究最多的是溶瘤腺病毒。Eriksson 等研究证明溶瘤腺病毒能特异性地感染具有干细胞特性的 CD44+CD24－ / low乳腺癌细胞，而不受乳腺癌干细胞耐药机制的影响，最终导致乳腺癌干细胞死亡。另外，有研究报道Ⅰ型单纯疱疹病毒的溶瘤突变体( HF10) 治疗 6例转移性乳腺癌患者，可杀灭 30% ～100% 的肿瘤细胞且患者无任何副作用发生。表明溶瘤病毒 HF10 是一种安全有效的生物制剂，能特异性杀灭乳腺癌干细胞。
　　4． 3 免疫治疗 免疫治疗是通过激活肿瘤患者 T 细胞的抗肿瘤反应，利用 T 细胞识别并聚集到肿瘤抗原表达部位而产生免疫应答反应，从而杀灭肿瘤细胞。树突状细胞( dendriticcell，DC) 在 T 细胞识别过程中发挥至关重要的作用，因此，利用 DC 疫苗为基础，是治疗乳腺癌是目前最有前景的免疫治疗方法。DC 是功能最强的抗原提呈细胞，在肿瘤的特异性免疫应答和适应免疫应答中起重要作用。通过体外扩增 DC，再回输到体内，可引发机体针对肿瘤特异抗原的细胞毒 T 淋巴细胞( cytotoxiclymphocyte，CTL) 反应，诱导肿瘤细胞死亡。将 DC 与乳腺癌干细胞融合后制备成肿瘤疫苗，能有效清除乳腺癌干细胞，而不损伤正常组织。有研究表明，将乳腺癌干细胞 mＲNA 导入 DC，通过体外扩增 mＲNA 的方法获得具有强烈诱导 T 细胞毒活性和乳腺癌干细胞特异性较强的悬浮细胞-mＲNA-DC 瘤苗，其诱导的 CTL 在体外特异性杀伤乳腺癌干细胞能力显着增强( P ＜ 0. 01) 。成为目前最有前景的免疫治疗方法。
　　4． 4 端粒酶拮抗剂治疗 端粒酶是一种具有逆转录活性的核蛋白酶，在正常人体组织中端粒酶活性被抑制，但在多数肿瘤细胞中端粒酶活性异常升高。其与恶性肿瘤的形成、转移密切相关，还可使正常细胞获得永生。乳腺癌干细胞具有永生性，因为高表达端粒酶能够延缓其衰老，而端粒酶拮抗剂则能够拮抗端粒酶活性，从而诱导乳腺癌干细胞凋亡。因此，利用端粒酶拮抗剂治疗乳腺癌是一种有应用前途的新技术。希望通过不断的研究，会有更多的端粒酶拮抗剂诞生。

　　5 问题及展望

　　传统的化疗主要是针对已经分化成熟的肿瘤细胞，可以使肿瘤体积变小，但由于没有彻底杀灭肿瘤干细胞，肿瘤仍可复发和转移。因此，乳腺癌治疗应以乳腺癌干细胞为重点。然而，基于乳腺癌干细胞的治疗还面临诸多难题。首先，目前亟需解决的问题就是如何分选出高纯度的乳腺癌干细胞。虽然，分离乳腺癌干细胞的方法诸多，但每种方法仍存在着其自身的缺陷性，如表面分子标志物是否能特异性的识别乳腺癌干细胞; 染料外排分选法对实验本身的要求较高，因此要研究寻找精确、特异的乳腺癌干细胞表型标记。
　　其次，如果寻找到乳腺癌干细胞维持其干性的相关信号传导通路，可为乳腺癌干细胞的靶向治疗提供新靶点，对靶向杀伤乳腺癌干细胞具有重要的指导意义。此外，靶向性诱导乳腺癌干细胞分化也是今后治疗乳腺癌的新策略。

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