近来研究证实肿瘤干细胞存在于白血病、神经胶质瘤、乳腺癌和前列腺癌等肿瘤中 , 其在肿瘤的发生、发展、转移中起关键作用 , 是未来抗肿瘤治疗的重要靶点之一。目前 , 肝癌干细胞的生物学行为已成为肝癌研究的热点之一。本研究应用体外无血清悬浮培养法获得肝癌干细胞 , 以探讨肝癌干细胞的生物学行为。
材料与方法
一、材料
1. 细 胞 系 和 实 验 动 物：人 肝 癌 细 胞 系MHCC97H 为中山大学附属第三医院肝移植中心实验室保存样本。6～8 周龄 BABL/c 裸鼠购自中山大学实验动物中心。实验过程中对裸鼠的处置按照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》的相关规定进行 , 符合动物伦理学管理要求。
2. 主 要 试 剂 和 仪 器：DMEM/F12 培 养 基 和DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司 , B27 购自美国 Invitrogen 公司 , 谷氨酰胺、肝素、胰岛素购自美国 Sigma 公司 , 人表皮生长因子和人碱性成纤维生长因子购自美国 Peprotech 公司 , 人白血病抑制因子购自美国 Chemicon 公司。荧光显微镜购自日本Nikon 公司 , 聚合酶链反应 (PCR) 扩增仪、电泳槽和凝胶成像分析仪购自美国 Bio-Rad 公司。
二、方法
1. 人肝癌细胞及干细胞的培养：无血清培养基为不含胎牛血清的DMEM/F12(1:1) 培养基，并添加谷氨酰胺 (2 mmol/L)、人表皮生长因子 (20 ng/ml)、人碱性成纤维生长因子(20 ng/ml)、2% B27 (1:50)、人白血病抑制因子(10 ng/ml)、肝素钠 (1 U/ml)、胰岛素(4 U/L)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100U/ml)。人肝癌MHCC97H细胞由含10% 胎牛血清DMEM培养基常规培养。取对数生长期的人肝癌MHCC97H 细胞，0.25% 胰酶消化后吹打成单细胞悬液 , 以<104/ml 密度接种至无血清培养基 , 加入培养瓶 ,竖直放入培养箱培养 ,每日摇晃数次。人肝癌MHCC97H 干细胞形成微球 ,每2～3 d 半量换液 1 次 , 每 6～8 d 为 1 代 , 获得稳定传代的人肝癌MHCC97H干细胞。
2. 肝癌干细胞表面标志物的检测：包括分化群 (CD)133、CD90、上皮细胞黏附分子 (epithelialcell adhesion molecule，EpCAM) 信 使 核 糖 核 酸(mRNA) 含量的检测 , 分别取对数生长期人肝癌MHCC97H 干细胞微球和人肝癌 MHCC97H 细胞 , 胰酶消化离心后得到细胞沉淀。磷酸盐缓冲液 (PBS) 漂 洗 3 次 , 取 1×106个 细 胞 , 常 规 提 取RNA, 进行逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR), β- 肌动蛋白 (β-actin) 为内参照。CD133 引物序列：上游 5' -ACCGCTCTAGATACTGCTGT-3', 下 游 5'-ATTCGGAGGACGTGTACGAT-3' 。CD90 引 物 序列：上 游 5'-AACCTGGGAGAGACTTGGAT-3', 下游 5'-AATGCTGGAGATGCTCAGTT-3'。EpCAM 引物序列：上游 5' -GTCAATGCCAGTGTACTTCA-3',下 游 5'-GTCCTTGTCTGTTCTTCTGA-3'。β-actin引物序列：上游 5' -CGTACCACTGGCATCGTGAT-3', 下 游 5'-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'。PCR 反应条件：95 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 15 s,72 ℃ 32 s, 35 个 PCR 循环。采用荧光定量 PCR 方法检测 mRNA 含量。
3. 克隆形成实验：分别取对数生长期人肝癌MHCC97H 细胞和人肝癌 MHCC97H 干细胞微球 , 胰酶消化收集细胞 , 吹打成单细胞悬液 , 将细胞稀释成 1×103/ml, 分别吸 50、100、200 μl 接种于96 孔板 , 各孔补加培养基至 300 μl。晃动培养板使细胞分布均匀。培养 7 d 后 , 吸去各孔培养基 ,PBS 漂洗 2 次 , 各孔加 200 μl 结晶紫染色液 , 充分覆盖孔底 , 20 min 后将 96 孔板置于自来水下冲洗 , 冲洗后晾干 , 计算集落数。克隆形成率 = 集落数 / 细胞接种数 ×100%。
4. 肿 瘤 细 胞 侵 袭 实 验 (Transwell 实 验 )：按 1:2.5 比例将 Matrigel 胶 ( 基质胶 ) 与无血清DMEM 培养液混匀后包被 Transwell 上室底部。分别取对数生长期人肝癌 MHCC97H 细胞和人肝癌 MHCC97H 干细胞微球 , 制备单细胞悬液计数 , 在上室内加入 1×104个细胞 , 用含 1% 胎牛血清 DMEM 培养基培养。在下室内加入含 10% 胎牛血清 DMEM 培养基。每组细胞重复 3 个样本 ,常规培养 48 h 后取出上室 , 擦去微孔膜上层细胞后用 HE 染色 , 光学显微镜下观察微孔膜下层细胞并计数。观察 5 个视野 , 取其平均值作为穿膜细胞数。
5. 裸鼠成瘤实验：分别取对数生长期人肝癌MHCC97H 细胞和人肝癌 MHCC97H 干细胞微球 , 制备单细胞悬液计数 ,按2×103、2×104、2×105个 /只分别接种于BALB/c 裸鼠背部左侧或右侧皮下,每组6 只裸鼠 , 4 周后处死裸鼠 , 观察成瘤情况。
三、统计学方法
应用 SPSS 11.0 统计软件进行数据分析。计量资料采用 ±s 表示，两种细胞实验数据的比较采用t 或 t′ 检验。以 P<0.05 为差异有统计学意义。
结 果
一、人肝癌干细胞生长情况
人肝癌 MHCC97H 细胞接种于无血清培养基后 , 细胞呈圆形悬浮于培养液中；12 h 后大部分细胞沉于瓶底 , 有部分细胞贴壁生长 , 仍有少量细胞悬浮；2 d 后有细胞球生成 , 每个细胞球含 3～8 个细胞 , 呈圆形 , 规则无突起 , 折光性较强；7 d 后细胞球明显增多、体积增大、致密 , 为规则的圆形或卵圆形（图 1）。
二、人 肝 癌 干 细 胞 CD133、CD90、EpCAMmRNA 含量
人 肝 癌 MHCC97H 干 细 胞 CD133、CD90、EpCAM mRNA 平 均 含 量 分 别 为 32.70±0.20、66.30±0.32、115.40±4.00, 人 肝 癌 MHCC97H 细 胞分 别 为 1.27±0.29、13.60±1.36、1.34±0.40, 人 肝 癌MHCC97H 干细胞 CD133、CD90、EpCAM mRNA 含量明显高于人肝癌 MHCC97H 细胞 (t′=117.8, 53.97,83.37；P<0.05)。
三、人肝癌干细胞单克隆形成情况
人肝癌 MHCC97H 干细胞的克隆形成率为(213±10)%, 人 肝 癌 MHCC97H 细 胞 为 (54±11)%,差异有统计学意义 (t=13.11, P<0.05)。
四、人肝癌干细胞侵袭能力
通过 Transwell 实验发现 , 人肝癌 MHCC97H干细胞穿膜细胞数为 (587±120) 个 / 视野 , 人肝癌MHCC97H 细胞为 (97±13) 个 / 视野 , 差异有统计学意义 (t=6.38, P<0.05；图 2）。
五、人肝癌干细胞侵袭体内成瘤能力
裸 鼠 成 瘤 实 验，接 种 2×103个 人 肝 癌MHCC97H 干细胞，1 只裸鼠 4 周可形成皮下移植瘤，成瘤率 1/6；接种 2×104个人肝癌 MHCC97H 干细胞裸鼠成瘤率 3/6；2×105个人肝癌 MHCC97H 干细胞可使全部裸鼠形成皮下移植瘤 , 成瘤率 6/6。至少需要接种 2×105个人肝癌 MHCC97H 细胞裸鼠才能形成皮下移植瘤 , 成瘤率 2/6。
讨 论
肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的关键因素 , 越来越多证据表明 , 在各种肿瘤标本中存在少量肿瘤干细胞。有文献报道 , 干细胞可以在无血清培养基中以微球体方式生长 , 此微球体培养方法已经成功应用于神经干细胞、脑肿瘤及乳腺癌干细胞的分离培养中。
血清中许多成分会诱导细胞分化 , 而无血清培养基能使胚胎干细胞处于未分化状态。Singh等和 Hemmati 等研究发现 , 利用无血清培养基并且添加生长因子的悬浮培养法可以分离和培养出多种肿瘤干细胞。据文献报道 , 人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子有利于正常干细胞体外扩增；人白血病抑制因子有助于保持干细胞未分化状态 , 并延长干细胞体外扩增时间；B27作为血清替代物 , 既保留了细胞赖以生存的必需营养物质 , 又去除了血清中的促分化剂；肝素钠除了有公认的抗凝血和抗血栓作用外 , 还具有调节免疫、调节多肽生长因子和抑制细胞增殖等多种生物学活性。本研究通过对添加成分的优化 , 在不含胎牛血清的 DMEM/F12(1:1) 培养基中添加谷氨酰胺、人表皮生长因子、人碱性成纤维生长因子、B27、人白血病抑制因子、肝素钠 , 成功富集到大量稳定传代的人肝癌 MHCC97H 干细胞微球体。
肝 癌 干 细 胞 的 标 志 物 有 CD133、CD90、EpCAM 等。本研究发现 , 人肝癌 MHCC97H干细胞的 CD133、CD90、EpCAM 表达量明显高于人肝癌 MHCC97H 细胞。结果证实 , 经无血清悬浮培养法培养后 , 肝癌干细胞或干细胞样细胞的比例显着上升 , 富集效果明显。为了证实培养得到的微球体具有肿瘤干细胞特性 , 我们对其生物学行为进行了深入的研究。通过 Transwell 实验发现 , 人肝癌 MHCC97H 干细胞侵袭能力明显高于人肝癌 MHCC97H 细胞。此外 , 本研究发现 , 人肝癌 MHCC97H 干细胞具有很高的成瘤能力 , 只需要 2×103个就能在裸鼠皮下形成肿瘤 , 而人肝癌MHCC97H 细胞则需要至少 2×105个才能成瘤。
总之 , 采用无血清悬浮培养法可培养并富集人肝癌 MHCC97H 干细胞。与人肝癌 MHCC97H 细胞相比 , 人肝癌 MHCC97H 干细胞具有更强的侵袭性和更高的成瘤率。
参 考 文 献
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