某一物种或某一类基因普遍存在同义密码子非均衡使用的现象，即密码子偏好性，其中最常使用的一种或几种特定的同义密码子被称为最优密码子。大肠杆菌、细菌、古菌、拟南芥、玉米、水稻、籼稻、杨树、鱼、牦牛、大豆等不同物种的某一类功能基因在密码子使用上存在着明显的偏性，而且某些特定基因密码子使用频率与其功能在一定的范围内呈现正相关趋势。然而，有关逆境相关基因密码子用法特征分析还少见报道。因此，拟以来源于不同植物的17个逆境相关基因完整的CDS序列为对象，运用Codon W软件分析各基因的密码子使用特性，并结合SPSS软件使用聚类分析的方法比较不同基因密码子偏好的差异，以期为植物逆境相关功能基因资源的高效利用提供参考。
1 数据来源和分析方法
1.1 数据来源
从GenBank下载几种植物逆境相关基因的全长编码区序列（coding DNA sequence，简称CDS），其在NCBI数据库的登录号见表1。其中，CarNAC基因与植物生长发育的调节以及多种环境胁迫的响应有关，CarPRPl基因在拟南芥中的过量表达能显着增强植株抗盐和抗冷冻胁迫的能力，MvNHX1、MvP5CS、MfNHX、MfP5CS基因与植物耐盐抗旱性相关，M v D R E B 1基因是耐寒性相关基因的转录因子，AdNHX、SsNHX、CgNHX、KfNHX基因与植物耐盐抗旱性相关。以上基因在作物抗逆基因工程上均具有潜在应用价值。【表1】
1.2 密码子使用特性分析
运用密码子分析软件Codon W1.4.2，计算以下衡量同义密码子使用偏性的主要参数：密码子第三位T含量（T3s）、密码子第三位C含量（C3s）、密码子第三位A含量（A3s）、密码子第三位G含量（G3s）、密码子适应指数（CAI）、密码子偏爱指数（CBI）、最优密码子使用频率（FOP）、有效密码子数（ENC）、密码子第三位GC含量（GC3s）、全长基因GC含量（GC）、同义密码子相对使用度（RSCU）。
1.3 密码子使用偏好性的聚类分析
利用SPSS16.0对来源于不同植物的17个逆境相关基因进行密码子使用偏性的聚类分析。在对基因密码子使用概率分析时，将每一条基因作为一个对象，同义密码子的RSCU值作为变量，采用59个同义密码子的RSCU值对其密码子使用偏性进行分析。基因间的距离规定为同义密码子相对使用度的欧拉平方距离。构建距离系数矩阵，并进行基于该系数的聚类分析。
2 结果与分析
2.1 逆境相关基因同义密码子使用偏好性分析
由表2可知，CarPRP1基因的ENC值小于40，表明该基因具有较强的密码子使用偏好性；而CarNAC4-6、CarEP1、MvNHX1、MvDREB1、MfNHX、AdNHX、SsNHX、CgNHX、KfNHX的ENC值较高，均大于50，表明这类基因密码子使用的偏好性较弱。进一步分析这些不同逆境相关基因的GC含量，发现CarPRP1基因的GC含量较高，在0.50以上；而其余基因（CarNAC5除外）的GC含量较低，均在0.35~0.45之间。从密码子第三位碱基来看，除CarNAC5基因之外，其余基因密码子第三位的碱基T和A的含量均高于C和G的含量，即密码子第三位碱基含量表现出A/T＞C/G的规律，且密码子第三位的A和T的含量远高于C和G。由此可见，CarNAC5基因与其余逆境相关基因的密码子用法明显不同，CarNAC5基因中绝大部分密码子第三位分布的是G或C碱基，其他逆境相关基因密码子第三位分布的则是A或T碱基。【表2略】
2.2 不同逆境相关基因同义密码子的使用频率
从表3中看出，在59个同义密码子中，CarNAC1、C a r N A C 2 、 C a r N A C 3 、 C a r N A C 4 、 C a r N A C 5 、CarNAC6、CarPRP1、CarEP1、MvNHX1、MvP5CS、MvDREB1、MfNHX、MfP5CS、AdNHX、SsNHX、CgNHX和KfNHX基因分别有27、24、27、27、25、29、21、26、26、26、24、25、26、25、23、30和27个密码子的RSCU值大于1，它们中80%的密码子以A或T碱基结尾。由此可见，这些逆境相关基因偏爱A或T结尾的密码子。另外，根据同义密码子相对使用度可以看出，不同的逆境相关基因中，Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val和Tyr在表达过程中频繁利用的密码子分别为GCT/GCA、TGT、GAT、GAA、TTT、GGA/GGT、CAT、ATT、AAA、CTT、AAT、CCA/CCT、CAA、AGA、TCA/TCT、ACA、GTT和TAT。由此可见，不同植物的逆境相关基因表达，每一种氨基酸均存在最优密码子。【表3略】
2.3 不同植物逆境相关基因密码子使用频率差异
各基因间的距离系数越大，则它们在表达过程中密码子使用频率的差异越大。由表4可知，除CarPRP1基因之外，NAC基因家族、CarEP1基因、NHX同源基因、P5CS同源基因、DREB基因相互之间的距离系数相对较小，距离系数均在7.500以下。
根据距离系数进行聚类分析，从图1中看出，MvP5CS和MfP5CS基因之间密码子用法差异相对较小，聚为一亚类；MvNHX1和MfNHX基因聚为一亚类；NHX同源基因中，CgNHX、KfNHX和AdNHX三个基因的距离较近，聚为一亚类，而SsNHX基因与之关系稍远，但同为一类；CarNAC1和CarNAC3基因成为一亚类；其他基因再分别依据距离系数分类。总的来说，同源基因之间密码子的偏好性差异较小。【表4略.图1】
3 结论与讨论
对来源于不同植物的17个逆境相关基因密码子的用法分析发现，CarPRP1基因的GC含量较高，其余基因的GC含量较低。根据ENC值分析可得，CarPRP1基因表现出较强的密码子使用偏好性，其余逆境相关基因密码子使用的偏好性中等或较弱。该结论与张乐等报道的GC含量越高的基因密码子使用偏好性越高的结论相一致。
进一步分析发现，大部分逆境相关基因的密码子第三位碱基表现出A/T含量大于C/G含量这一规律，而CarNAC5基因则相反，密码子第三位碱基的C/G含量大于A/T含量。与此同时，由基因同义密码子使用频率分析得知，在不同植物的逆境相关基因中，80%的密码子仍以A或T碱基结尾。因此，可以认为所选的逆境相关基因偏爱A或T结尾的密码子。此外，在各个基因中，每个氨基酸在同义密码子使用上都存在明显的偏好性，主要偏爱使用A或T结尾的密码子，与前人报道的双子叶植物基因组密码子偏爱特性趋势一致。
密码子使用偏好性产生的生物学基础目前还不是很清楚，近几年研究中通过对模式生物密码子用法的研究，发现同义密码子使用偏好性主要由突变偏性、翻译选择或两者共同作用产生。不同物种或同一物种的不同基因对密码子的用法特性有所不同，这种密码子使用偏好性差异大小与物种的亲缘关系远近有关，亲缘关系越远，密码子偏好性差异越大，越近则差异越小。
因此，根据目前发现的编码区密码子使用的偏好性和使用信息进行聚类分析，可为上述基因在抗逆基因工程中的应用提供理论依据，同时为基因工程技术提供高效表达的基因源，从而提高我国抗逆性作物的育种水平，为我国干旱半干旱地区的开发和利用打下基础。
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