基因测序论文（核心期刊范文8篇）

　　基因测序技术是分子生物学、生物工程领域一项重要的基础技术手段，其应用前景非常广泛，现已在生物学、基础医学等领域发挥着重要作用。本文汇总了8篇“基因测序论文范文”，以供参考和研究。

　　基因测序论文（核心期刊范文8篇）之第一篇：基因测序技术发展及生物医学应用

　　摘要：基因测序技术在分子生物学和基础医学领域应用广泛, 已经从第一代发展到第四代:第一代测序技术测序精确, 是常用的单基因病诊断技术, 但通量较低, 成本高;第二代测序技术测序通量提高, 在临床上发挥重要作用;第三代测序技术在测序通量、时间和成本方面都有极大改善;第四代测序技术还在实验阶段。本文主要介绍了第一代、第二代和第三代测序技术的优缺点和在生物医学领域的应用, 第四代测序技术的研究进展。

　　关键词：基因测序,基因诊断,生物医学

　　基因组携带了个体的全部遗传信息, 基因测序能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解, 在诊断与治疗方面都发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后, 基因测序技术的发展更加迅猛, 在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。化学裂解法是基于PCR的DNA测序法[1], 可以对未知基因进行检测, 但是不能读取长的PCR产物片段, 所以很快被Sanger的双脱氧链末端终止法取代, 此为第一代基因检测技术。以高通量为特点的下一代基因测序技术 (Next Generation Sequencing, NGS) 包括大规模平行签名测序 (Massively Parallel Sequencing, MPS) 、聚合酶克隆测序 (Polony Sequencing) 和连接测序 (Sequencing-by-Ligation) 等, 此为第二代检测技术, 是目前应用最为普遍的测序技术。目前第三代测序技术单分子实时测序已经成熟, 而以纳米孔为基础的第四代测序技术也已崭露头角。本文简要概括了四代基因测序技术的发展特点及其生物医学应用。

　　1 第一代基因测序技术

　　MAXAM和GILBERT[1]发明的化学裂解法, 其基本原理是特定化学试剂可对碱基进行特异性修饰, 在修饰碱基处 (5’或3’) 打断磷酸二酯键将一个DNA片段的5’端磷酸基做放射性标记, 再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基, 从而产生一系列长度不一而5’端被标记的DNA片段, 这些以特定碱基结尾的片段通过凝胶电泳分离, 再经放射自显影, 确定各片段末端碱基, 从而得出目的DNA序列。该方法能够检测双链DNA, 但是其操作繁琐, 程序复杂, 被同时期的Sanger双脱氧链终止法取代[2]。

　　双脱氧链末端终止法测序是1977年由SANGER提出, 其原理是将2’, 3’-双脱氧核苷酸 (dd NTP) 参入到新合成的DNA链中, 由于参入的dd NTP缺乏3’-羟基, 因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键, DNA合成反应将终止。测序时分成四个反应, 每个反应中加入DNA聚合酶、待测模板、引物、四种脱氧核糖三磷酸 (d NTPs) , 除此之外还要加入一种双脱氧核苷三磷酸 (dd NTPs) , 然后进行反应, dd NTPs随机取代相应的d NTPs, 由于其3位的羟基变成了氢, 不能继续延伸, 使正在延伸的寡聚核苷酸选择性的在A、T、C或G处终止。终止的核苷酸由相应的dd NTPs决定, 通过电泳可分离出长度不同的片段, 再对这些片段的末端碱基进行检测从而获得所测片段的碱基序列。最初对凝胶片段末端碱基的检测是用同位素标记法, 20世纪80年代, 用荧光进行标记, 可自动测序, 到20世纪90年代, 随着毛细管电泳技术以及微阵列毛细管电泳技术的发展, 测序的通量得到大幅度提高。

　　双脱氧链末端终止法的优点有:

　　1) 可用于未知或已知突变的检测, 更容易实行;

　　2) 假条带的出现减少, 结果更加清楚;

　　3) 读取的长度也较长;

　　4) 因为掺入了同位素标记的三磷酸, 末端终止法可以测更小序列的核苷酸链;

　　5) 基本适用于所有的突变类型, 准确率几乎100%, 在单基因病的基因诊断和产前诊断中仍广泛使用。

　　双脱氧末端终止法的缺点:

　　1) 离不开PCR扩增, 且只能分析单个的DNA片段, 通量小, 不能进行基因组层面的分析;

　　2) 自动化程度低, 检测速度慢, 对于某些需要快速检测的疾病不适合;

　　3) 双脱氧链末端终止法成本高, 不适用于大规模测序。

　　在过去的几十年, 第一代测序技术一直作为基因诊断的标准, 在基因病特别是单基因病症病人和各种遗传性酶病如苯丙酮尿症、自毁容貌综合症等其他疾病的诊断上发挥着举足轻重的作用, 是最常用的基因测序技术[3]。

　　2 第二代测序技术 (NGS)

　　尽管SANGER的双脱氧链末端终止法已经提高了DNA测序的速度, 但是在费用和效率上仍有不足, 高通量、成本低的下一代测序技术 (Next generation Sequencing, NGS) 诞生了。大多数的NGS都是通过合成进行测序, 每个目标NDA片段绑定到一个芯片上, 然后加入被标记的核苷酸, 在NDA聚合酶的作用下延长, 高分辨率的摄像头捕获并整合每个核苷酸信号, 标出空间坐标和时间坐标, 每个位点的DNA序列通过计算机推断出来[4]。在NGS中, 具有许多测序平台, 如, 454焦磷酸测序 (454Pyrosequenceing, ) , 能够进行较长长度的准确读取[5], Illumina (Solexa) 合成测序是运用最为广泛的NGS[6], 测序的技术原理是采用可逆染料标记终止核苷酸边合成边进行测序反应, 与454焦磷酸主要不同在于, 连接寡核苷酸的流通槽代替了含有微珠的芯片以及终止末端使用的是染料而不是焦磷酸。SOLi D测序技术第一次出现是在2007年, SOLi D也要经过乳液PCR, 这与454焦磷酸相同, 它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连接合成为基础, 取代了传统的聚合酶连接反应, 可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。

　　NGS还包括其他方法, 像大规模平行签名测序 (Msssively Parallel Signature Sequencing, MPSS) , 聚合酶克隆测序 (Polony Sequencing) , 所有这些第二代基因测序技术都有一个共同点, 测序反应进行的同时可以收集反应信号。与第一代测序技术相比, NGS的优势非常明显:

　　1) 高通量, 高准确性, 高灵敏度;

　　2) 自动化程度高;

　　3) 成本低;

　　4) 可用于未知物种, 未知基因的检测。

　　NGS的应用十分广泛, 在基因组学、转录组学, 表达组学方面都有重要作用, 在临床上主要有三个方面的应用:

　　1) 通过检测基因突变对肿瘤进行诊断, 例如:在对纤维板层肝细胞癌 (FL-HCC) 进行RNA测序时发现一个嵌合转录, 正常肝没有, 通过全基因组测序得知, 这个嵌合转录是19号染色体400个碱基缺失造成的, 对病人的检测表明, 与肝癌的发病机制有关[7]。结合全基因组扩增技术, SALVIANTI等人[8,9]探究了NGS对单细胞的分子特征进行检测的可行性。他们采用了乳腺癌细胞株, 成功地对其中5个细胞进行了测序, 在18个基因中发现了27个变异, 但是, 单细胞水平的基因诊断成为新的医疗方法还需要不断的探究优化。

　　2) 建立合适的靶向治疗。在一个检测肺癌突变基因的测序试验中, FENG等人[10]利用靶向测序对来自45个肺癌患者标本的737个基因位点进行基因突变的鉴定, 发现突变经常发生在EGFR, KRAS, PIK3CK和TP53这些基因中, 并且, 在部分样本中, 在这些关键基因中会有两个或三个突变。不同类型的肺癌对应不同的基因突变, 靶向测序可以识别这些突变, 可对进行个体化肿瘤测序以及靶向治疗进行指导。在非小细胞肺癌中, 抗EGFR (表皮生长因子) 靶向治疗经常涉及单点突变, 但在恶性胶质瘤中, 抗EGFR靶向治疗是由复杂的表观遗传学调控。NGS特发性耐药机制的应用似乎比单基因检测更为容易[11,12]。

　　3) 靶向测序技术 (Targeted Sequencing) 在未知病因的疾病诊断方面开启了新的一面, 尤其在产前诊断中具有重大意义。传统的产前筛查都是利用羊膜穿刺术, 具有很大的流产风险, 现在胎儿染色体异常可利用无创产前筛查 (Non-Invasive Prenatal Screening NIPS) 手段进行检测, 母体血清中含有与胎儿染色体异常相关的游离DNA (cellfree DNA, cf DNA) [13,14], 在对孕妇进行NIPS基因测序后表明, 基因测序与常规核染色体分析的结果比较一致[15]。在高危孕妇中, 针对唐氏综合症和爱德华氏综合征的产前检测表明, 大规模平行测序对细胞游离DNA测序的假阳性率远远低于传统产前筛查 (0.3%vs.0.6%, 唐氏综合症;0.2%vs.0.6%, 爱德华氏综合征) , 阳性预测率也有显着差别 (45.5%vs.4.2%, 唐氏综合症;40.0%vs.8.3%, 爱德华氏综合征) , DNA测序的结果要明显优于传统的产前筛查, 而且只需要抽取母体的血液即可检查, 方便快捷[16]。

　　3 第三代测序技术 (单分子DNA测序)

　　为了更好地发掘DNA信息, 研究人员开发了新一代测序方法, 单分子测序技术, 即第三代基因测序技术, 包括Heliscope测序技术, SMRT (Single Molecule Real Time, 单分子实时测序) 离子半导体测序技术 (Ion Torrent) 等技术。较为成熟的是SMRT测序技术。

　　SMRT测序技术的原理:四种d NTP的γ-磷酸被不同荧光标记, 被DNA聚合酶捕获, 与模板链互补的碱基形成磷酸二酯键, 荧光基团被聚合酶切掉, 作用时间较长, 荧光能够被激发检测到信号, 而不能和模板匹配的碱基, 停留的时间很短不能被检测。根据标记荧光基团光谱的不同来区分不同碱基, 得出DNA序列。单分子荧光信号由零级波导技术 (Zero Mode Waveguide, ZMW) 检测[17], 在一片附着在透明基质的金属薄膜上蚀刻出许多直径数十纳米的小孔, 可以将激发光局限在这个小孔内, 小于检测激光的波长, 形成检测空间, DNA聚合酶就被固定在这个区域, 只有在这个区域内碱基携带的荧光基团才能被激活检测, 降低了背景荧光干扰。SMRT的荧光基团标记在核苷酸3’磷酸上, 在DNA链延长的过程中被切去, 减少DNA合成的空间位阻, 而第二代的荧光基团都标记在5’端甲基上, 随着DNA链的延伸会产生三维空间位阻, 导致错读。

　　SMRT优点:

　　1) 超长读取;

　　2) 无需模板扩增;

　　3) 运行时间短, 读取速度可达每秒10个碱基;

　　4) 能够直接检测表观修饰位点。

　　第三代基因测序技术可以直接检测RNA的序列, 对唐氏综合症的检测有重大意义。个体大多数的发育过程都是由miRNA调控的, 不同胎儿发育过程可由母体血浆细胞外的miRNA反射。1 043条miRNA, 来自七例唐氏综合症妊娠孕妇和相同年龄相同胎儿性别的正常孕妇, 通过高通量PCR检测发现, 695条miRNA确定可被用作唐氏综合症产前诊断的生物标志物。虽然第二代基因检测技术已经能够对母体血浆内cf DNA进行分析, 但是假阳性出现的概率仍然很大, 结合miRNA的检测可提高确诊的准确性[18]。

　　4 第四代测序技术 (纳米孔测序)

　　DNA测序经历了三代的发展, 现在进入到第四代———单分子纳米孔测序时代。自从1996年第一次有关纳米孔的报道出现后, 以纳米孔为基础的单分子测序技术迅速成为基因测序技术的热点[19]。纳米孔测序技术正朝着无需标记, 长读取 (104~106个碱基) , 高通量, 少样本制备的方向发展, 将会成为低成本快速进行基因检测的选择。牛津纳米孔公司 (Oxford Nanopore Technologies) 已经开发了小型的商业用途的迷你测序仪。

　　用于DNA测序的纳米孔可大致分为两类:生物纳米孔和固态纳米孔。生物纳米孔, 也称作跨膜蛋白通道。α-溶血素 (α-HL) 是第一种也是运用的最多的纳米孔, α-溶血素是金黄色球菌分泌的一种外毒素, 是一个蘑菇状的七聚体跨膜通道, 能够快速将自己插入到平面双成膜中, 在最窄处形成一个1.4 nm宽的纳米通道, 内直径与单链DNA的直径 (约1.3 nm) 相近, 因此, 单链DNA可以通过。而且, 此纳米孔结构可以耐受将近100℃的高温和宽范围p H[20,21]。但是, α-溶血素的β-桶结构限制了它直接检测长链DNA分子。耻垢分枝杆菌孔蛋白A也是生物纳米孔的一种, 但是最近的一项研究发现, 本来关闭状态的含有MSCL (Mechanosensitive channel of large conductance) 蛋白通道, 在合适的电压范围内, 会为单链DNA打开。含有MSCL的蛋白通道对四种核苷酸的膜张力不同, 而且四种不同的核酸通过时会有不同的点电信号和机械信号, 这提高了信噪比, 并且DNA的转移速率比耻垢分枝蛋白A低了一个数量级, 在DNA测序方面是一个很有吸引力的蛋白孔[22]。

　　由于微细加工技术的发展, 固态纳米孔也逐渐得到关注, 其在化学、热、机械稳定性、大小可调性和整合性方面都优于生物纳米孔。而且, 固态纳米孔可以在多种实验条件下工作并且可以通过传统的半导体工艺大规模生产。常见的固态纳米孔有Si3N4、Si O2、Al2O3、BN、石墨单原子层、聚合物膜和其他混合材料, 其中Si3N4和Si O2因为低机械应力和高化学稳定性应用最为广泛, 他们可以通过互补金属氧化物半导体兼容的工业集成电路工艺来制造。有报道这两种纳米孔被用于检测DNA分子[23]。目前, 固态纳米孔最大的一个缺点是不能分辨尺寸相近的分子, 不过这点不足可以通过表面功能化修饰和附加特定的序列与受体来解决。

　　纳米孔测序技术可用于以下方面:

　　1) 检测单链DNA。CLARKE等人[24]研究表明, α-HL共价结合一个传感器分子通过测量电流能够连续的识别没有标记的单核苷酸 (d AMP、d CMP、d GMP、d TMP) 。

　　2) 检测双链DNA片段, 噬菌体Phi29纳米孔最小直径为3.6 nm, 允许单链DNA和双链DNA以及一些蛋白质分子通过。

　　3) 重复序列和Poly结构的测定。

　　4) 检测蛋白质。目前纳米孔的应用研究最多的是对DNA的检测, 也可用于蛋白质的检测, 因为蛋白质在大小、结构、电荷等性质方面比DNA多样化, 检测也更困难。ACHARYA等人[25]通过纳米孔技术检测了折叠蛋白质的稳定性和单氨基酸突变造成的影响。

　　5) 在医学和临床上, 特别是在癌症方面的研究起着引领作用。

　　5 总结与展望

　　近十几年, 基因测序技术迅猛发展。虽然第一代测序技术仍然活跃在各个检测平台, 但第二代、第三代测序仪已相继问世, 第四代测序技术也日趋完善。第一代到第四代测序技术都有优势与不足。

　　1) 第一代测序技术SANGER测序成本高、通量低、读长较长, 有较高的准确率, 对于较少样本测序仍是最佳选择。

　　2) 第二代测序技术已发展成熟, 高通量、低成本的特点使其在大规模测序工作中广泛应用, 但是测序读长相对较短是第二代测序技术的主要缺陷。

　　3) 第三代测序技术不仅提高了读长, 而且可以直接检测RNA序列和甲基化序列。第三代测序技术仍然在不断开发中, 其中Ion torrent测序技术前期文库制备过程繁琐, 读长不足;SMRT测序技术的有效反应孔数目不足, 原始测序数据准确率不高。

　　4) 第四代测序技术建立在第三代测序技术之上, 与前三代技术相比较, 代表性的纳米孔测序技术在成本和速度方面都得到大幅提升, 仪器也更加小型化。

　　基因测序技术作为人类探索生命奥秘的重要手段之一, 对生命科学和生物医学等领域的发展起到了巨大的推动作用。尽管目前最为先进的纳米测序技术具有诸多进步, 但仍面临很多挑战, 例如DNA控制和纳米孔制造技术还处于实验室阶段。我们有理由相信, 新一代测序技术的难点会逐渐克服, 基因测序指导下的遗传病诊治、个性化精准医疗等能够更加高效的进行, 未来基因测序技术必将对人类健康产生重大影响。

　　参考文献
　　[1]MAXAMA M, GOLBERT W.A new method for sequencing NDA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977, 74 (2) :560-564.
　　[2]SANGER F, NICKLEN S, COULSON A R.DNA sequencing with chain-terminating inhibitors[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977, 74 (12) :5463-5467.
　　[3]郭奕斌.基因诊断中测序技术的应用及优缺点[J].遗传, 2014, 36 (11) :1121-1130.
　　[4]JEFFREY G, ELIEZER M, VAN A.Next-generation sequencing to guide cancer therapy[J].Genome Medicine, 2015, 7 (1) :80.
　　[5]MARGULIES M, EGHOL M, ALTMAN W E, et al.Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J].Nature, 2005, 437 (7057) :376-380.
　　[6]HODKINSON B P, GRICE E A.Next-generation sequencing:a review of technologies and tools for wound microbiome research[J].Advances Wound Care, 2015, 4 (1) :50-58.

　　基因测序论文（核心期刊范文8篇）之第二篇：基因测序在慢性肾脏病中的作用分析

　　摘要：慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)一直是困扰全世界的重大卫生问题,CKD患者面临着高发病率、高死亡率及高住院率的风险,因此CKD的早期筛查和干预对患者预后改善有重大意义。但很多慢性肾脏病患者因临床症状不明显,无法明确诊断而失去了早期治疗的机会。随着人类基因组计划的进行和基因测序技术的发展,越来越多的基因被证实与囊性肾病、法布里病和常染色体显性遗传性肾小管间质病变(autosomal dominant tubulointerstitial kidney disease, ADTKD)等多种慢性肾脏病息息相关。这些基因通过与环境共同作用或孟德尔遗传的方式影响CKD的发生和发展。本文旨在从慢性肾脏病的诊断、治疗、生育指导和移植前评估等方面介绍基因测序技术在慢性肾脏病中的意义。

　　关键词：慢性肾脏病,基因测序,遗传,产前诊断

　　慢性肾脏病(chronic kidney diseases,CKD)是指由各种原因引起的慢性肾脏结构异常和功能障碍(肾脏损害病史≥3个月),包括肾GFR正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常,及影像学检查异常,或不明原因肾小球滤过率(GFR)下降[ <60 mL·min-1·(1.73 m2)-1]≥3个月[1]。CKD给世界带来了沉重的经济卫生负担,因此提升CKD的诊断、治疗效率迫在眉睫。

　　在过去的四十余年时间里,基因测序技术飞速发展,由经典的Sanger方法到如今的基因组合(gene panel)、新一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)等,基因测序的速度和效率大幅提升并在多个领域广泛应用。近年来,越来越多的研究证实,基因测序在单基因遗传肾脏病和其他遗传相关性肾脏病的诊断、治疗指导等方面有重大意义,成为了CKD诊疗的重要辅助手段。

　　一、基因测序与CKD的诊断

　　1.辅佐确立诊断

　　常染色体显性遗传性肾小管间质病变(ADTKD),是一种罕见的遗传性小管间质病变,目前已知有4种主要的突变基因UMOD、UMC1、REN与HNF1B,4种基因通过不同的途径致病。依据KDIGO指南,患者本人或家系中一位成员以上存在上述4种基因之一检测阳性结合临床表现即可确诊ADTKD。另一种比较典型的遗传性肾病是法布里病(Fabry`s Disease),这是一种由X染色体上GLA基因突变导致的遗传性疾病,该病以α-半乳糖苷酶A(α-galactosidaseA, α-GalA)活性下降为特点,最终引起肾脏、心脏、神经等多系统损伤,甚至导致患者死亡。对于疑似患者,常通过外周血白细胞中α-GalA活性的检测来确立诊断。在男性中,α-GalA活性低于25%～30%即可确诊[2]。但是女性患者的临床表现往往较男性患者轻,在酶学检查中常呈正常或正常偏低,因此基因测序成为此类患者诊断中必不可少的一步。

　　2.疾病分型或修正诊断

　　以局灶节段硬化型肾小球肾炎(focal segmental glomerular sclerosis, FSGS)为例,该病可分为原发和继发性,且有多种病因和病理类型,若未对患者进行病因诊断而一味地使用激素治疗,往往效果较差。一项研究测序了179个家系中的193例确诊FSGS患者的基因,发现基因测序对于FSGS的诊断率为11%,且在病理确诊的患者中COL4A突变率高达55%[3],证实了基因测序在FSGS患者病因诊断中的有效性及COL4A突变是导致继发性FSGS的主要基因之一。另外有研究证实基因测序对CKD的诊断率为9.3%,特别是对遗传性肾脏病和未知原因的CKD有较高的诊断率(分别为23.9%和17.1%)[4]。

　　最常见的遗传性肾脏病,多囊肾病(PKD)往往可以通过家族史和较为明显的影像学表现确诊。依据不同的遗传学特征,可分为常染色体显性遗传多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)和常染色体隐性多囊肾病(autosomal recessive dominant polycystic kidney disease, ARPKD)。ADPKD常见于成年人,多在30～50岁发病,其主要致病基因为多囊肾基因-1(polycystic kidney disease-1, PKD-1)和多囊肾基因-2(polycystic kidney disease-2, PKD-2)的显性突变,他们分别占ADPKD的85%和15%[5]。临床研究表明,PKD-2突变患者的临床症状较轻,预后也明显优于PKD-1突变患者,其发展至ESRD的时间比PKD-1患者晚近15年[6]。而ARPKD多于儿童期甚至是婴幼儿期发病,除了上面提到的PKD-1和PKD-2基因的隐性突变外,还有一些其他的致病基因。一项捷克的研究表明,在符合ARPKD诊断标准的患者中PKHD1的检出率高达90%[7]。通过基因测序可以对新发突变(de novo mutation)、无明确家族史疑似多囊肾病患者确诊,也可根据突变基因将临床确诊的多囊肾病区分为不同的亚型,并根据不同亚型的预后指导患者的治疗。

　　二、基因测序与CKD的治疗

　　1.基因导向治疗

　　法布里病患者的临床症状主要是由αGAL-A活性降低导致的,对基因测序阳性的患者进行酶补充治疗往往有一定的临床治疗效果[8],除此之外,对于GLA基因的错义突变所导致的法布里病,Migalastat可以通过提升α-GalA的活性改善病情,获得更好的预后[9]。有研究表明部分激素抵抗型肾病综合症(steroid resistance nephrotic syndrome, SRNS)合并线粒体脑病的患者多有辅酶Q10相关基因的病变,通过外源性补充辅酶Q10,可以使患者的临床症状得以缓解[10]。再如部分非典型溶血性尿毒症患者的病因是补体基因突变,导致大量补体异常激活,因此补体抑制剂衣库株单抗(eculizumab)对于这类患者有较好的疗效[11]。

　　2.治疗方案优化

　　如前文所提到的,对于临床表现为FSGS的患者,若基因测序提示有Alport综合征相关基因突变,则提示可能为继发性FSGS,临床应用激素治疗的效果有限,使用环孢素及其他对症治疗方法收益更大,而有PAX2突变的患者,免疫抑制剂的作用效果则较差,应适当考虑其他治疗方法[12]。而在ADTKD患者中,UMOD突变常常会导致血尿酸的升高,因此针对有该突变的患者,可以适当预防性应用别嘌呤醇以预防痛风[13]。

　　3.避免药物不良反应

　　高尿酸血症患者的治疗中,别嘌呤醇是一种常用的降尿酸药物,但是由于某些人群特别是亚洲人种中存在HLA-B5801基因,使得很多患者出现严重的过敏反应[14]。因此,我国患者应在使用别嘌呤醇之前常规筛查该基因,并建议基因阳性患者换用其他药物。

　　三、基因测序与CKD的生育指导

　　1. 遗传咨询

　　许多CKD具有遗传风险,Alport综合征是一种以COL4A(A3, A4和A5)基因突变导致的胶原蛋白Ⅳ结构改变为特征的疾病。一般通过血尿的临床表现、阳性家族史和病理学活检即可确立诊断。对于临床确诊Alport综合征且有生育需求的患者,其亚型检测就显得十分必要,如X连锁基因COL4A5突变的男性患者,对其后代性别进行选择即可以极大地降低后代患有同种疾病的机率。另外对于常染色体遗传的COL4A3、4A4突变或PKD1、PKD2突变患者,基因测序可以合理地估计后代患病概率,并给出相关生育建议。

　　2.产前诊断

　　常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)的患者有50%的几率将致病基因传递给后代。该病患者常需要终身接受治疗,为家庭带来了巨大的负担,其中男性患者常常伴有死精症、精子活动力低下等异常,因而难以正常孕育后代[15]。使得体外受精结合胚胎植入前诊断成为有生育意愿的ADPKD患者的首选方法。有文献报道,这种方法可以将患者后代的患病率降至1%～2%[16],最大限度的避免了计划外流产。植入前诊断一方面可以针对ADPKD的单基因位点如PKD1/PKD2进行测序,另一方面对于单基因测序阴性的胚胎,还可以通过对患者全部家族成员进行基因连锁分析(linkage-analysis)提高诊断的准确度[17]。同时,这种诊断方法具有一定的局限性,如对于无明确家族史的患者难以进行基因连锁分析,又或现有基因测序手段对新发突变胚胎诊断能力有限,在一定程度上降低了该方法的准确性;另外,这种方法仍有一定的风险,如多胎妊娠、出生缺陷和卵巢过度刺激,同时可能给患者及患者家庭带来较大的心理、经济负担,外加胚胎选择的伦理学问题,使其在世界范围的推广受到了诸多限制。因此,应在与患者进行充分沟通之后尊重患者的意愿决定是否使用该产前诊断技术[18]。而常染色体隐性遗传多囊肾病(ARPKD)患者常常表现较轻,且基因突变位点多而冗杂。常规的超声检查可以在孕中期对ARPKD进行诊断,但诊断时间往往较晚且存在漏诊的可能。单基因测序是目前唯一能够早期诊断该疾病的方法[19],特别是对某些新发突变有着更高的确诊率。有多例病例报道提示基因测序可以对超声漏诊或者是疑诊的胎儿期多囊肾病起到确诊的作用[20,21]。除了经典的PKD1、PKD2基因外,也有文献报道PKDH1基因在多囊肾病的产前诊断中有一定意义[22]。有系统文献回顾提出,对于超声发现的双侧肾脏囊性改变,特别是伴有肾脏外症状的胎儿,推荐进行全外显子测序或基因组合测序。但是对于单侧囊性改变及无肾脏外症状的胎儿,并不推荐进行基因测序,因为该项检查会有一定的机率引起早产和出生缺陷,并为家庭带来较为严重的心理负担[23]。

　　四、基因测序与CKD移植前评估

　　对于终末期肾脏病患者来说,肾脏移植治疗往往成为了最终的选择,但是肾脏移植的存活率对供体和受体均有一定的要求。供体或受体的基因异常都可能会导致移植失败。

　　最近一项在700余例患者中进行的关于肾移植排斥的研究显示,基因位点LISM1编码某种组织相容性抗原,该基因发生突变是引起肾脏移植免疫排斥的重要原因[24]。此外,曾有多项研究表明,在非裔美国人中高表达的APOL1基因使其CKD进展至终末期肾病的概率大大高于欧裔美国人[25],将APOL1基因列入活体肾移植前的常规检查十分有必要。同样的,对于年轻的可能患有多囊肾病的活体肾移植捐献者,影像学检查有时并不能检出患者潜在的肾脏异常,此时PKD1和PKD2基因的测序就有十分重要的临床意义,可以通过排除潜在的多囊肾病患者提升移植手术成功率[26]。

　　小结与展望

　　综上可见,基因测序在CKD的诊断、治疗、产前诊断和移植前评估等方面均有重要作用。但CKD基因测序的全面推广还面临着许多问题:部分致病基因及其突变位点过于繁杂(如UCM1)[27,28],增加了全面测序的难度;产前诊断中风险和收益难以权衡;基因测序的价格仍然较为昂贵,对技术的推广造成阻碍。同时这也是未来研究的努力方向,相信遗传学研究和基因测序技术的进一步发展会为CKD的诊疗带来突破。

　　参考文献
　　[1] World Health Organization.Mortality and global health estimates:Causes of death;Projections for 2015-2030;Projection of death rates[R/OL].
　　[2] Schiffmann R,Hughes DA,Linthorst GE,et al.Screening,diagnosis,and management of patients with Fabry disease:conclusions from a “Kidney Disease:Improving Global Outcomes” (KDIGO) Controversies Conference[J].Kidney Int,2017,91(2):284-293.
　　[3] Yao T,Udwan K,John R,et al.Integration of genetic testing and pathology for the diagnosis ofadults with FSGS[J].Clin J Am Soc Nephrol,2019,14(2):213-223.
　　[4] Groopman EE,Marasa M,Cameron-Christie S,et al.Diagnosticutility of exome sequencing for kidney disease[J].N Engl J Med,2019,380(2):142-151.