基因测序论文（核心期刊范文8篇）之第八篇
摘要：近年来基因测序技术不断取得突破性进展, 基因测序技术也经历的技术也更新换代, 使得测序精度不断提高, 成本和测序时间也大大下降。2014年1月, 美国Illumina公司发布HiSeq X Ten高通量基因测序平台, 标志着人类真正进入1000美元一个基因组的时代, 基因进行解读变得不再遥远。随着基因测序技术的发展, 人们对疾病有了更多的认识, 根据患者不同基因型, 提供更具个性化的治疗方案, 往往能够降低治疗成本, 提高用药安全性和有效性, 对药物经济学研究产生影响。
关键词：基因测序,药物经济学,成本,个性化治疗方案
随着生命科学的不断进步发展, 人们对自身的认识不断加深, 而关于人类自身基因信息对健康的影响也得到了极大的关注。自从人类基因组计划 (Human Genome Project) 完成以来, 基因测序技术得到了飞速的发展, 原先需要花费27亿美元巨额资金, 由全球最顶级科学家共同协作多年才完成的全基因组测序变的不再那么遥不可及, 这不仅加快了对人类基因组信息研究, 同时也让人们更多的了解了疾病的原理, 给疾病的预防和治疗带来新的思路。
1 基因测序的发展
基因测序 (Gene Sequencing) , 是指分析特定DNA片段的碱基序列 (A、G、C、T) 的排列方式。基因测序技术最早可以追溯到上世纪50年代, 1954年Whitfeld等科学家就利用化学降解法测定了多聚核糖核苷酸的序列, 受到技术发展的限制, 这种方法未被广泛应用。1975年, Frederick Sanger发明了Sanger双脱氧链终止法 (Chain Termination Method, 简称CTM) 。该测序过程通过聚合酶连锁反应 (Polymerase Chain Reaction, 简称PCR) 将双脱氧核糖核酸随机地加入到正在合成中的DNA片段里。被加入了双脱氧核糖核酸的DNA链将不能继续增加长度, 于是便得到了所有可能的不同长度DNA片段。通过将双脱氧核糖核酸进行不同的荧光标记, 并用毛细管电泳法分离由PCR反应获得的所有DNA片段, 再用激光作用使跑到最末端的DNA发出荧光, 计算机便可根据颜色自动判断该位置上的碱基。
自上世纪90年代以来, 包括着名的人类基因组计划在内的所有的DNA测序操作几乎全部采用了半自动化毛细管电泳Sanger测序法。但随着近年来分子生物学的发展, 人们对基因测序的需求与日俱增, 传统基因测序技术无论在效率上还是成本上, 己经远远不能满足现在的需要。2005年以后, 以高通量基因测序为中心的新一代基因测序技术不断成熟, 与之前相比, 新一代测序技术具有高通量、低成本、需要样本量小、仪器和分析方法先进等特征。目前应用最多的新一代基因测序平台有3种:Roche公司的454测序系统、Illumina公司的Solexa测序系统及ABI公司的SOLiD测序系统。这些新型测序系统都使用了一种新的测序策略循环芯片测序法 (Cyclic-array Sequencing, 简称CAS) , 所谓循环芯片测序法, 简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应以及荧光序列读取反应。
2011年, Pacific Biosciences公司推出了以单分子DNA测序为主要特征的第三代测序技术, 即单分子实时DNA测序 (single molecule real time DNA sequencing) 技术。该技术采用一种新的荧光类似物标记脱氧核苷酸, 通过显微镜实时记录单个碱基的荧光强度变化, 根据荧光的波长和峰值判断碱基类型, 从而克服了前两代测序技术必须进行PCR扩增的缺陷。与之前相比, 该项技术最大优点就是单分子测序, 无需进行PCR扩增, 可直接读取序列信息, 快速简便。尽管目前具有读长有限、碱基错配率高等一些不足, 但随着技术的不断改进, 该技术通量高、速度快、价格低、起始测序拷贝量低等优点在未来将会得到很好的应用。
2 测序技术在临床上开展应用的关键因素
基因测序技术之前主要还是在科学研究领域开展应用, 但近年来该项技术开始从实验室走向临床, 并得到了广泛的关注, 这主要是由于以下几点因素:
2.1 测序成本大大降低
1986年开始开展的人类基因组计划 (HGP) 是最早对人类进行全基因组测序, 该项目由美国 (54%) 、英国 (33%) 、日本 (7%) 、法国 (2.8%) 、德国 (2.2%) 和中国 (1%) 共同完成, 耗资达到27亿美金。新一代测序技术的出现降低了测序的成本, 但相对应用于个人医疗领域, 还是过于高昂, 普通患者难以承担。其中最着名的案例为已故苹果公司CEO斯蒂夫.乔布斯患癌期间, 进行了全基因组测序, 当时所花费的费用约为10万美金。
2014年1月, 美国Illumina公司发布HiSeq X Ten高通量基因测序平台, 具估算, 其主要成本为仪器运行所需的试剂成本 (797美元/基因组) , 仪器的折旧成本 (137美元/基因组) , 加上技术人员准备样品进行测序的人力成本 (55-65美元/基因组) , 该技术首次将人类全基因组测序的成本控制在1000美金以内, 基因测序应用于个人医疗领域变得不再遥远。下表对基因测序的成本进行了比较, 只有当测序价格变得合适, 这项技术才有可能会进入到日常医疗中来。
2.2 测序的效率大大提升
每个人的基因组约包含30亿个碱基对, 在测序时, 为了保证数据的准确性, 通常要进行多次测序, 在这一过程中产生大量数据, 使得测序工作需要耗费较长的时间。
同样以目前普遍认为最先进的HiSeq X Ten测序平台为例, 每台测序仪能够在三天时间内生成1.8terabases的数据, 相当于16个人类基因组。据Illumina介绍, 每台HiSeq X Ten每年能够对18000人进行全基因组测序, 并保证每个基因组都能达到平均30x的测序深度, 这意味着每个碱基平均被读取30次。
2.3 疾病和基因组关系
疾病与基因的关系主要基于对基因致病点位的分析, 特别是对特定致病基因序列挖掘和关联进行分析, 这往往需要特定的分析手段来研究和预测不同疾病, 并依靠大量的数据进行验证和对比分析。随着测序技术的不断发展, 人们可以获得大量基因变异位点信息, 以及位点之间的结构信息和基因变异的群体特征, 从而可以在群体水平上进行群体遗传分析, 即全基因组关联分析 (GWAS) 。
全基因组关联分析是在全基因组范围内通过选择遗传变异的点位进行基因分型, 比较病例和对照组间每个变异频率的异差, 从而计算变异与疾病的关联强度, 选出最相关的变异进行验证并确认变异位点与疾病之间的关系。只有对基因信息更加全面的解读, 才能有效的将这一技术运用到疾病预防和治疗中去。
3 测序技术的发展对药物经济学的影响
药物经济学主要是研究各类预防、诊断、治疗和疾病管理等干预措施的成本效果。基因测序技术不仅在上述领域都有所应用, 而且在药品研发, 疾病研究, 优生优育等方面也都得到了广泛的应用和关注。
测序成本的迅速下降和效率的提高使这项技术在临床应用上变得可能, 它可以给人们带来了更全面的个人信息。通过基因测序可以了解自身遗传状况, 提前对某些疾病进行预警, 并根据自身情况制定个性化的预防措施和治疗方案。这些具有针对性的举措, 结合了每个人的特异性及受不同疾病或药物影响差异性, 可以很大提高预防和治疗疾病的安全性和有效, 降低药物副作用, 减少不良反应, 并能有效的控制治疗成本, 减少过度医疗。
对基因测序进行药物经济学评价可以从两方面入手。一是疾病成本的评价 (cost of illness assessment) , 也可以称为疾病的经济负担 (burden of disease, BOD) 。二是经济学评价, 主要是成本效果分析 (cost-effectiveness analysis, CEA) 和成本效益分析 (cost-benefit analysis, CBA) 。
3.1 疾病负担的研究
疾病负担主要是两方面, 一方面是流行病学负担, 另一方面是疾病的经济负担。前者主要从流行病学角度, 说明通过基因检测可以提早预防的疾病的危害程度, 包括疾病的发病概率、患病率、死亡率和因病造成的伤残率。可以使用增加一个生命年或增加一个质量调整生命年 (QALY) 的成本。
通过基因检测可以预防疾病的成本包含直接成本 (直接医疗费用及个人和家庭的投入) 、间接成本 (因病造成的劳动力经济损失) 和无形成本 (因失去生存质量、紧张、疼痛及忧虑造成的经济损失) 。
以唐氏综合症为例, 唐氏综合症即21-三体综合症, 又称先天愚型或Down综合症, 是由于21号染色体的异常导致的疾病系。60%患儿在胎内早期即流产, 存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。而只需对孕周12周以上的高危孕妇外周血血浆中的游离基因片段进行基因测序, 即可对胎儿染色体非整倍体疾病21-三体综合症、18-三体综合症和13-三体综合症进行提前诊断, 该项检测避免羊水穿刺的流产风险。目前我国已正式批准该项技术应用于临床检测。
在考虑疾病成本时, 不仅可以从个人角度考虑, 也可以从社会角度考虑由于发病、伤残 (失能) 和过早死亡给社会带来的经济损失和由于预防治疗疾病所消耗的医疗资源。
3.2 基因测序的成本效果分析
凡是在基因测序后通过采取预防措施, 减少某些疾病发病率或死亡率都可以采用成本效果分析。
以乳腺癌为例, 遗传性乳腺癌 (Breast Cancer) 直接与人体细胞核第17号染色体上的BRCA1和位于13号染色体上的BRCA2有关, 它们具有调节人体细胞复制、对遗传物质DNA的损伤修复、抑制恶性肿瘤发生等作用, 如果这两个基因的结构发生突变, 它所具有的抑制肿瘤发生的功能就会受到影响。BRCA1基因突变者, 患乳腺癌和卵巢癌的风险风别为50%-85%和15%-45%, BRCA2基因突变者, 患乳腺癌和卵巢癌的风险分别为50%-85%和10%-20%。2013年5月, 好莱坞影星安吉丽娜·朱莉进行了预防性双侧乳腺切除手术, 正是因为朱莉的BRCA1基因缺陷, 而她的母亲就是由于乳腺癌而死。
进行成本效果分析, 在计算成本时, 不能仅仅考虑基因测序的成本。基因测序, 尤其是全集因组测序, 与传统的预防措施不同, 在测序过程中带有无目的性, 测序过程并不针对某一疾病, 且测序本身并不能产生任何实质性的预防作用。这一特性类似于健康检查, 但与健康检查不同, 测序结果更多的是指向患某些疾病的可能性, 但这些疾病尚未出现任何相关的临床症状, 而仅仅是预示了未来可能出现的症状, 如果通过某些途径提前预防, 可以降低未来出现该疾病的概率, 这一点又与疫苗相类似。所以在估计成本时需要包括三个方面, 一是基因测序的成本, 二是采取预防措施的成本, 三是直接治疗成本和分摊的间接成本。
通过基因测序来预防某些疾病所产生的效果, 可以是减少发病率、死亡率、增加期望寿命 (LE) 、健康期望寿命 (经校正后的期望寿命DALE) , 延长生命年 (years of life saved) 或增加生存质量 (quality of life) 效用值来表示。
3.3 基因测序的成本效益分析
根据基因测序应用的目的不同, 可以是在疾病出现前采取相应预防措施, 也可以是在疾病出现后根据个人基因特性制定个性化的治疗方案, 后者更适合使用成本效益分析。
以非小细胞肺癌为例, 近年来, 临床试验发现对于发生EGFR突变和EML4ALK融合的患者, 靶向激酶抑制剂的疗效要优于传统的化疗方案;EGFR酪氨酸激酶区域的突变与非吸烟的非小细胞肺癌密切相关, 并且对EGFR的靶向药物 (吉非替尼) 很敏感;存在ALK突变的非小细胞肺癌对ALK抑制剂 (克里唑替尼) 高度敏感;KRAS的错义突变会导致对EGFR抑制剂的拮抗。
通过这些案例, 在治疗疾病时, 尤其是治疗复杂疾病, 可以先通过基因测序, 了解患者的个人基因信息, 从而根据测序结果提出针对患者的个性化治疗方案。这些方案考虑到了患者的个体特异性, 可以很大提高疾病的治疗的安全性和有效, 降低药物副作用和不良反应发生的几率。
目前这一方法在多种疾病的治疗过程中已经得到运用, 更多靶向药物的出现也使得对疾病的治疗变得更精确。在对这些治疗方案进行药物经济学研究时, 个性化的治疗方案在的临床表现上往往效果更好, 且成本能得到更好的控制。
4 基因测序技术发展中遇到的问题
目前基因测序技术正处于高速发展阶段, 但从应用角度上说还为时尚早。主要原因为:
4.1 成本和测序效率依然满足不了市场需求
尽管Illumina的HiSeq X Ten已经将测序的成本降至1000美元, 但高昂的设备购买和维护费用以及需要专业的团队进行操作阻碍了该项技术向日常应用的普及。目前全基因组测序仍以科研使用为主, 将其应到到日常医疗中来, 还需要降低设备的成本, 提高测序的效率, 简化测序的操作程序。
4.2 需要对人类基因组做更多的认识
人类目前对基因的认识还十分有限, 从2001年第一次揭开人类基因组神秘面纱至今, 科学家对基因的认识依然不足, 目前对人类基因80%—90%的内容尚不了解, 真正明确其原理的只不过是冰山一角。目前做的很多测试依然只是基于统计学来进行分析和预测, 其生理学角度的相关性没有得到充分的论证。
4.3 测序精确度不足
现阶段基因测序的准确率依然不高, 即使在美国形成产业的基因测序机构中, 其准确率也不过维持在85%左右, 这使得测序结果中存在假阴性和假阳性的结果。加之基因测序结果很多用于表达和某些疾病的关联性, 但这些疾病可能还尚未发生, 又缺少其他验证途径, 使得基因测序的结果也受到很多人的质疑。
4.4 测序结果与疾病的关联性问题
基因是一串遗传密码, 但其并永久不变, 如果环境发生改变, 基因所表现的功能就有可能发生改变。事实上很多疾病的发病机制很复杂, 并不仅仅和基因有关联, 生活环境、个人习惯等等很多诱因都会导致基因突变。即使不发生突变时, 某些可能导致疾病发生的基因使携带者本身患病的概率也不是一定的, 据统计, 携带BRCA1和BRCA2突变基因的人群中, 依然有20%的人在不接受干预的情况下不会患乳腺癌。
此外, 基因检测没发现问题的也非一劳永逸, 不注意营养和运动, 生活没规律一样会生病。所以, 关于基因与个人健康的关系, 还需要更多的研究论证。
4.5 基因测序的伦理学问题
基因是每个人最深层次的秘密, 揭开这层秘密将带来不可估量的伦理学问题。如对未来配偶进行测序, 确定两人后代是否会结合父母的隐性致病基因, 从而判断未来后代可能存在的遗传性疾病, 这关系到选择性生育的伦理问题, 已上升到社会角度。
再设想有人通过基因测序得知自己未来可能患有某种疾病, 而这种疾病可能再经过几十年甚至一辈子都没有发生, 但接受测序的人在得知结果后的生活中可能都被这一结果影响, 造成生理和心理上的影响。
总结
基因测序这项技术在过去几十年取得了巨大的发展, 但这项技术的完全应用还需要人们对基因有更多的认识, 也必须依靠其他相关科学技术的同步发展, 同时, 社会需要有一系列法律法规来规范和引导该项技术的合理运用。
在目前的阶段, 对基因测序结果的分析在临床上尚缺乏一个理想的预测模型, 这还需要临床专家与基础科学家共同开展研究, 建立可以验证预测重大疾病风险的模型, 并通过药物经济学来对其进行有效性和经济性评价, 让这项技术真正造福广大人民。
参考文献
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