0、 引言
猪瘟( classical swine fever，CSF) 是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒( classical swine fever virus，CSFV) 引起的一种具有高死亡率和高度传染性特征的疾病，对全世界的养猪业造成极大的破坏． CSFV 是单股正链RNA 病毒，基因组大小约为 12． 3 KB，编码一个大的多聚体蛋白，蛋白酶将其裂解成 12 种蛋白，包括 8 种非结构蛋白( P7、Npro、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B) 和 4 种结构蛋白( 囊膜糖蛋白 Erns、衣壳蛋白 C、E1、E2) ，其中，5'-UTR、3'-UTR、NS5B 基因序列比较保守，而 NS5B 常用于 CSFV 基因分型． 目前我国猪瘟的防控仍然采取疫苗免疫为主的策略，但是由于缺乏相应的血清学标志和配套的鉴别检测方法，使得通过抗体检测很难区分免疫弱毒和野毒感染，不利于猪瘟的净化． 近年来猪瘟免疫失败常有报道，主要是由于免疫不当所造成的母源抗体干扰和免疫耐受，导致非典型猪瘟和慢性猪瘟，使猪瘟的防治更加复杂．目前，猪瘟病毒的检测方法主要有血清学诊断方法、病毒分离培养、动物接种试验、ELISA 和 RT-PCR等，但是，血清学诊断方法可能会出现一定的交叉反应，难以区分CSFV、BVDV 和 BDV 感染，也很难鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种; 病毒分离培养和动物接种实验诊断周期长、操作繁琐、检出率低; RT-PCR 需要昂贵的实验仪器，不适合基层使用． 因此，需要建立一种快速、简便、适合基层使用的方法来鉴别猪瘟野毒感染和疫苗接种．环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification，LAMP) 是一种新型核酸扩增技术，选用 4 ～ 6条特殊引物( 内向引物 FIP/BIP、外向引物 F3/B3 和环引物 LF/LB) 识别靶序列 6 ～8 个特异性区域，具有极高的特异性; 然后利用具有链置换活性的 Bst DNA 聚合酶，60 ～65 ℃恒温催化新链合成，从而使靶基因达到高效扩增的目的，30 ～60 min 即可获得 109靶序列拷贝． LAMP 扩增产物为一系列序列反向重复的茎环结构和多环花椰菜样结构构成的 DNA 片段混合物，并产生焦磷酸镁沉淀，因此可通过观察白色沉淀、荧光染料颜色变化、凝胶电泳或斑点杂交等判定结果． 因此，LAMP 反应特异性强、灵敏度高、快速准确、操作简单，同时对生物污染物的耐受性强，可有效克服 PCR 反应中常见酶失活的问题，在病毒、细菌、寄生虫等病原微生物的临床检测中得到广泛应用． 在 CSFV 的 LAMP 检测方面，根据猪瘟病毒 5'-UTR、E2 或 NS5B 基因保守序列设计 LAMP 引物，建立了检测 CSFV 或 HCLV 的 LAMP 检测方法，其敏感性比 RT-PCR 高10 ～100 倍，与荧光定量 PCR 相当，但鉴别检测 CSFV 强毒和疫苗株 RT-LAMP 的报道还很少． 因此，本文在分析 CSFV 全基因组序列的基础上，设计 CSFV 强毒和疫苗株的特异性 LAMP 引物，分别建立了 CSFV 强毒和疫苗株的LAMP 检测方法，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对动物疫病感染的鉴别检测有重要意义．
1、 材料与方法
1． 1 毒株
CSFV 标准强毒株( shimen) 由河南省农业科学院动物免疫学实验室提供，猪瘟兔化弱毒疫苗株( HCLV)购自哈尔滨维科生物公司，以及实验室保存的 PRV、PCV2、PRRSV、JEV 等毒株．
1． 2 主要试剂
Bst DNA 聚合酶( 8U) ，10 × thermopol 反应缓冲液，dNTP mixture，DL2000 DNA marker，Ex Taq DNA 聚合酶，Mg2 +/ Mn2 +混合物，TRIzol，异丙醇，无水乙醇，氯仿，琼脂糖，DEPC，罗丹明 B 衍生物荧光指示剂由河南省农业科学院王德国老师惠赠．
1． 3 引物设计与合成
参照 GenBank 中登录的 CSFV 标准强毒株( shimen、Alfort、Brescia、Glentorf 等) ，疫苗株( HCLV、ChineseC、Rimes 等) 、不同基因亚型的 CSFV 野毒株，BVDV 和 BDV 的全基因组序列，利用 DNA star 软件进行比对，系统比较分析猪瘟强弱毒株的序列差异，确定鉴别检测的靶基因位于 NS5B 基因上，然后运用在线软件primer explorer v4 software 作为辅助，设计一套分别针对猪瘟弱毒疫苗株与强毒的 LAMP 引物( 包括 2 条外引物 F3/ B3，2 条内引物 FIP/BIP，2 条环引物 LF/LB) ，同时设计猪瘟强弱毒株的通用 PCR 引物( 包括上游引物 F 和下游引物 R，见表 1) ．【表１】
1． 4 病毒 RNA 的提取及 RT-PCR 鉴定
1． 4． 1 RNA 提取 取稀释过的猪瘟活疫苗及 shimen 株 300 μL 至灭过菌的 1． 5 mL 离心管中，用 TRIzol 试剂盒提取猪瘟病毒强毒株与兔化弱毒疫苗株的 RNA，然后加 13 μL DEPC 水溶解，用于 RT-PCR 反应．1． 4． 2 RT-PCR 依据 GenBank 中 CSFV NS5B 基因上的一段保守序列，利用 primer premier 5． 0 软件设计PCR 引物，进行 PCR 扩增． 先进行反转录，获得 CSFV RNA 后再进行 PCR 扩增，优化 PCR 循环参数，确定最佳扩增程序，然后用 1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定．
1． 5 猪瘟强毒株与疫苗株的 LAMP 检测方法的建立
LAMP 反应体系为 25 μL: Bst DNA 聚合酶 ( 8U) 1． 0 μL，10 × Bst buffer 2． 5 μL，dNTP ( 10 mmol / L)2． 5 μL，Mg2 +/ Mn2 +混合物 2 μL，混合引物( F3、B3: 5 μmol/L; FIP、BIP: 40 μmol/L; LF、LB: 20 μmol/L; 将稀释好的引物等体积混合) 共 6． 0 μL，CSFV 模板 cDNA 2． 0 μL，罗丹明 B 染料1 μL，灭菌双蒸水 8． 0 μL． 在上述 LAMP 反应体系基础上设置不同的反应温度( 61 ℃，63 ℃，65 ℃) ，选择猪瘟强毒株与疫苗株的最佳作用温度; 和不同的恒温作用时间( 20 min，30 min，40 min，50 min，60 min) ，选择猪瘟强毒株与疫苗株最佳反应时间．
1． 6 LAMP 特异性检测
用 PRV，PCV2，PRRSV，JEV，CSFV 的 DNA 或 cDNA 分别为模板，按照建立的 LAMP 反应体系和优化的反应条件进行扩增，扩增结束后 80 ℃加热 2 min，取 5 μL 核酸产物做 2%琼脂糖凝胶电泳，以鉴定 LAMP 扩增的特异性．
1． 7 LAMP 敏感性检测
将提取的 CSFV 强毒株与疫苗株 cDNA 分别用灭菌双蒸水做 10 倍倍比稀释( 101，102，103，104，105，106，107，108，109，1010) ，然后分别做为模板，按照建立的 LAMP 反应体系和优化的反应温度和时间进行扩增，扩增结束后 80 ℃加热 2 min，取 5 μL 核酸产物做 2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果．
1． 8 LAMP 扩增产物的可视化及琼脂糖凝胶电泳检测方法
可视化检测方法: LAMP 扩增结束后 80 ℃加热 2 min，用肉眼观察颜色变化，阳性为黄色，阴性为橙色．琼脂糖凝胶电泳检测: LAMP 扩增结束后 80 ℃加热2 min，取5 μL 核酸产物用 2%琼脂糖凝胶电泳 100 V 作用 30 min，观察结果．
1． 9 LAMP 重复性和稳定性试验
取等量 5 份不同代次的 CSFV 细胞培养物，分别提取 RNA 进行反转录，再进行 LAMP 检测，观察结果．取等量 5 份不同代次的 CSFV 细胞培养物，对每一代次重复 3 次进行 LAMP 检测，观察结果，以确定 LAMP检测方法的重复性和稳定性．
2、 结果
2． 1 CSFV 强毒株和疫苗株 RT-PCR 结果
根据设计的 CSFV 强毒株和疫苗株的特异性 PCR 扩增引物，所得靶序列的片段大小为 1 291 bp． 提取CSFV 强毒株和疫苗株 RNA 进行 RT-PCR 扩增，然后取 5 μL 核酸产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示，在目的条带处有清晰的特异性条带( 见图 1) ．
2． 2 CSFV LAMP 反应条件的确定
2． 2． 1 LAMP 反应温度的确定 由于 LAMP 反应是在 60 ～ 65 ℃ 条件下进行，故在 LAMP 基本反应体系基础上设置不同的反应温度( 61 ℃，63 ℃，65 ℃) 进行扩增，然后取 5 μL 反应产物做 2% 琼脂糖凝胶电泳，选择 LAMP 的最佳作用温度． 电泳结果见图 2，61 ℃，63 ℃ ，65 ℃ 都有较亮的特异性梯形条带产生，而 Bst DNA 聚合酶的最适作用温度为 65 ℃，因此选择 65 ℃作为 LAMP 反应的最适时间．2． 2． 2 LAMP 反应时间的确定 在反应体系基础上设置不同的恒温作用时间( 20 min，30 min，40 min，50 min，60 min) 进行 LAMP 扩增，然后取 5 μL 核酸产物做 2% 琼脂糖凝胶电泳，选择 LAMP 最佳反应时间． 电泳结果见图 2，20 min 时 LAMP 基本没有扩增，30 min，40 minLAMP 扩增浓度没有达到最大，50 min 时 LAMP 扩增达到最大，因此选择 50 min 作为 LAMP 反应的最适作用时间．
2． 3 LAMP 特异性检测
对 CSFV 强毒株和弱毒疫苗株以及 PRV，PCV2，PRRSV，JEV 分别取等量样品提取病毒 DNA 或 RNA，然后进行反转录，取2 μL 模板用优化好的 LAMP 体系进行检测( 见图3) ． 以强毒株为例，只有 shimen 株有特异性扩增，HCLV，PCV2，PRV，PRRSV，JEV 都没有特异性条带产生，说明建立的 LAMP 检测方法特异性良好．
2． 4 LAMP 敏感性检测
将强毒株和疫苗株 cDNA 分别做 10 倍倍比稀释，稀释倍数依次为 101，102，103，104，105，106，107，108，109，1010． 然后分别用建立的 LAMP 检测方法和 RT-PCR 方法进行扩增，测得各自的灵敏度( 见图 4) ． 以强毒株为例，RT-PCR 方法的最低检测限为 105稀释度，而 LAMP 方法的最低检测限为 108稀释度，因此 LAMP 方法的灵敏度要比 RT-PCR 技术高 1 000 倍．
2． 5 CSFV 强毒株和疫苗株的 LAMP 扩增可视化及琼脂糖凝胶电泳结果
在 LAMP 基本反应体系基础上，65 ℃恒温扩增 50 min，扩增结束后 80 ℃加热 2 min． 结果显示，图 5 中，编号1，3 为阳性，2，4 为阴性． 在 LAMP 基本反应体系基础上，65 ℃恒温扩增50 min，扩增结束后80 ℃加热2min，分别取 5 μL 核酸产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳 100 V 作用 30 min，观察电泳结果( 见图 6) ． 阳性有特异性梯形条带产生，而阴性没有．
2． 6 LAMP 重复性和稳定性试验
取等量 5 份不同代次的 CSFV 细胞培养物，分别提取 RNA 进行反转录，再进行 LAMP 检测，结果显示 5次检测结果均没有明显差异; 取等量 5 份不同代次的 CSFV 细胞培养物，对每一代次重复 3 次进行 LAMP 检测，结果显示 3 次重复间也没有明显差异．
3、 讨论
环介导等温扩增( LAMP) 是建立的一种新型核酸扩增技术，采用 6 条特殊引物( 内向引物 FIP/BIP、外向引物 F3/B3 和环引物 LF/LB) 识别靶序列的 8 个特异性区域，因此特异性极高; 利用具有链置换活性的 BstDNA 聚合酶，65 ℃ 恒温条件下催化新链合成，以达到对靶基因的高效扩增，50 min 即可获得 109靶序列拷贝． 正是由于 LAMP 扩增反应的高效性，因此容易出现携带污染和交叉污染而导致的假阳性结果． 从理论上讲，污染一模板分子就可以产生假阳性． 为了避免这种现象发生，在实验中要尽量杜绝气溶胶污染，每次实验都要设定阴性对照，扩增和检测应在不同的区域，来保证结果的准确性．本研究系统比较分析猪瘟强弱毒株的序列差异，发现 NS5B 基因上一段序列在猪瘟强弱毒株中差异较大，因此确定鉴别检测的靶基因位于 NS5B 基因． 在此基础上设计猪瘟弱毒株与强毒株的 LAMP 引物( 包括两条环引物) ，从而加快 LAMP 反应速度，实现对猪瘟强弱毒的鉴别检测． 指示剂罗丹明 B 以沟槽模式结合于单双链 DNA，阳性结果呈黄色，阴性结果呈橙色． 还可通过观察白色沉淀、荧光染料或斑点杂交判定结果; 利用 PicoGreen、SYBR GreenI 等荧光染料或实时监控浊度仪，可实现 LAMP/RT-LAMP 的实时定量检测．用建立的猪瘟强毒株的检测方法对各种基因型的强毒株进行检测，结果均是阳性，而对弱毒疫苗株和PRV，PCV2，PRRSV，JEV 等毒株进行检测，结果均是阴性; 建立的弱毒疫苗株的 LAMP 方法亦如此，说明建立的猪瘟强毒株和弱毒株的检测方法特异性良好． 同时对猪瘟强毒株和弱毒株的检测方法与 RT-PCR 方法比较，LAMP 检测方法的灵敏度比 RT-PCR 要高 1 000 倍． 此外，反应体系中 Mg2 +浓度、内引物浓度以及反应温度和时间都对试验结果有很大影响，因此，本实验经过反复多次摸索，最终决定 Mg2 +浓度为50 mmol / L，FIP、BIP 浓度为 40 μmol / L，并与其他 4 种引物等体积混合制成混合引物用于 LAMP 反应．综上所述，本研究所建立的猪瘟强毒株和弱毒疫苗株的 LAMP 检测方法快速，简便，特异性和敏感性高，为我国猪瘟防控与净化提供技术支撑，对动物疫病多重感染的鉴别检测有重要意义．
