梅毒危害极大,在我国曾一度被消灭,但随着近年来对外交流的日益频繁又死灰复燃,发病率呈逐年上升趋势。2012 年国家卫生部公布的甲、乙类法定报告传染病中,梅毒发病率较 2011 年上升 3. 27%,死亡率上升 5. 36%,应引起重视。因此早期检出患者,及时治疗,控制传染源,是控制梅毒传播的重要措施。梅毒检测方法有多种,现就梅毒螺旋体的实验室常见的诊断方法作一简要综述。
1、 病原体的检测
对患者分泌物进行观测,如发现运动的苍白螺旋体即可确诊为梅毒,该方法特异性高,但灵敏度稍低,容易漏检。梅毒检测适用于早期梅毒皮肤黏膜损害,对硬下疳尤为重要,因为人体感染 TP 3 ~6 周后,才能通过梅毒螺旋体抗原血清试验( TPHA) 、梅毒荧光抗体( FTA) 等敏感性、特异性较高的方法检测到血清中的抗体,在患者血清抗体达到可测水平之前,TP 检查是早期诊断梅毒最好的方法。
1. 1 暗视野显微镜( DF) 检查梅毒螺旋体暗视野检查法是梅毒病原体检测的主要方法。在皮损处,用玻片刮取组织渗出液或淋巴结穿刺液,用 500 × 暗视野显微镜观察,在暗背景上,梅毒螺旋体呈白色发光、运动快速、急促,也可较缓慢地围绕长轴旋转。根据其典型的形态、大小和运动方式,结合临床症状可直接诊断梅毒。暗视野检查法特异性高,适用于早期梅毒的诊断。但由于受病程、取材、检测人员技术水平以及部分患者不规则使用抗生素导致 TP 数量减少和活动力下降的影响,敏感性较低为 54. 4%,因此此法检查阴性也不能排除患梅毒的可能。该法简单、快速,但不适用于潜伏及晚期梅毒患者。且口腔中可能存在其他螺旋体,因此此法对口腔病灶材料亦不适用。
1. 2 活体组织检查梅毒螺旋体 常用银染色法( war-thin-starry) 或直接荧光抗体试验( DFAT) 检查活体组织梅毒螺旋体。银染色法能使梅毒螺旋体染成棕褐色或黑褐色,形态清晰易辩,且标本可以永久保存。但由于存在梅毒螺旋体类似物质的干扰,因此,银染色阳性结果的判断应慎重。特异性荧光抗体试验是用非致病性螺旋体培养物对抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体吸收后,再与异硫氰酸荧光素( FITC) 相结合,在荧光显微镜下判读结果。梅毒螺旋体发特异性黄绿色荧光,灵敏性稍高于暗视野检查法。可用于梅毒螺旋体与类似螺旋体的鉴别。
1. 3 多功能超高倍显微诊断仪( MDI) 是一种集光学、光电学、电子学、医学影像学和多媒体计算机技术于一体的高科技医学显微设备,其具有共轭变焦、高清晰度、高分辨率、高放大倍率的特点,有效放大倍率可达 20 000 倍以上。可以快速、便捷的进行标本观测。
其在Ⅰ期梅毒诊断的阳性率为 83. 75 %,但由于设备昂贵难以普及。
2、 梅毒血清学检查
机体感染梅毒螺旋体后可产生两种抗体,一种是抗梅毒螺旋体的特异性抗体( IgM 和 IgG) ; 一种是非梅毒螺旋体特异性的抗体,即反应素。梅毒血清学检查包括非梅毒螺旋体抗体检测( 非特异性抗体检测)和特异性梅毒螺旋体抗体检测。前者敏感性、特异性均较后者低,但由于抽血后 1 h 即可出结果,费用也低廉,因此常用于临床筛选。并且非特异性抗体在治疗后下降或消失,因此可判定治疗效果。后者敏感性和特异性均较高,主要用于确认试验,但由于其不随治疗下降或消失,故不能用于判定治疗效果。
2. 1 非梅毒螺旋体血清试验 非梅毒螺旋体血清试验检测的为非特异性抗体( 反应素) ,某些其他疾病患者如结核、红斑狼疮、类风湿性关节炎、猩红热等甚至健康人中也可出现反应素,因此可出现生物学假阳性。
此外,标本溶血或容器污染等亦可引起假阳性反应,其特异性较低。经治疗后患者反应素可消失或阴转,通常用于疗效观察、判断复发及再感染。
2. 1. 1 性病研究实验室试验( VDRL) : 以心磷脂、胆固醇及卵磷脂的混悬液作为抗原,与机体产生的反应素在体外发生反应。属于微量玻片法,操作简单、快速,对诊断神经梅毒有重要价值,敏感性可达 99%,特异性达 70. 8%。可作定量及定性试验,但对一期梅毒敏感性低。
2. 1. 2 快速血浆反应素环状卡片试验( RPR) : VDRL试验的改良。用标准活性炭颗粒吸附 VDRL 抗原,操作简单、快速,结果易于观察,灵敏度较 VDRL 高,是目前临床应用最多的检测方法之一。RPR 可检测滴度,滴度可在治疗后半年到 2 年下降 4 倍,滴度变化是观察治疗效果、复发或再感染的重要指标。RPR 试验和DF 方法相结合,可早期诊断梅毒。其缺点是反应素水平过高可产生假阴性结果。该法对神经梅毒、潜伏期梅毒不敏感。
2. 1. 3 不加热血清反应素玻片试验( USR) : 为改良的VDRL 试验,待检血清不需加热灭活,直接在玻片上进行絮状反应,肉眼判读结果。此法敏感性高而特异性较低,易发生生物学假阳性,亦可作为疗效观察、判断复发或再感染的指标。
2. 1. 4 甲苯胺红不加热血清实验( TRUST) : 其原理是以甲胺苯红染料颗粒代替炭颗粒作为指示物,当液体中出现凝集程度不同的红色凝块时即判为阳性,简便快速,结果判读以白色纸卡为背景,清晰易判,稳定性好。对于非梅毒螺旋体特异性抗体的检测,TRUST法的检出率和重复性均优于 RPR 法。但由于在梅毒感染的早期和潜伏期,血清中反应素很少,其检出率亦较低,分别为 72. 7%和 73. 7%。
2. 2 梅毒螺旋体血清试验 此类试验采用的抗原是梅毒螺旋体或其成分,检测血清中的抗梅毒螺旋体IgM 和 / 或 IgG 抗体,其敏感性和特异性均较高,一般用作确证试验。但由于特异性 IgG 抗体可终身存在,因此不能用作疗效观察。
2. 2. 1 梅毒螺旋体血球凝集试验( TPHA) : 该法使用甲醛处理的羊红细胞做抗原载体,吸附从兔睾丸中提取后经超声波粉碎的 Nichols 株梅毒螺旋体菌体抗原,检测血清中抗梅毒螺旋体特异性抗体。为排除非特异性反应,待测血清需经吸收剂( 兔睾丸提取物、正常兔血清及超声处理的密螺旋体无毒株 Reiter 株) 吸收,因此 TPHA 具有高度的敏感性和特异性,是目前临床常用的梅毒血清学确证试验。其缺点是抗原制备困难,试剂较昂贵,操作较繁琐,且易发生自凝现象。
2. 2. 2 梅毒螺旋体明胶凝集试验 ( TPPA) : TPPA 与TPHA 不同的是用明胶颗粒代替羊红细胞做抗原载体,吸附梅毒螺旋体 Nichols 株菌体抗原,从而避免了TPHA 法血球易自凝而造成的漏诊。TPPA 敏感度和特异性均较高,分别为 99. 2% 和 97. 0%,在临床上亦常用于梅毒血清学确证试验。该法操作简便、快速,结果易于判断,但同样由于试剂价格较昂贵而使其在临床的大规模使用受到限制。
2. 2. 3 荧光密螺旋体抗体吸收试验( FTA-ABS) : 是一种间接荧光抗体法,其先以密螺旋体无毒株( Reiter株) 超声裂解抗原吸收待检血清,除去具有交叉反应的抗体,再与梅毒螺旋体菌体作用,然后加入荧光素标记的抗人 IgG。此法敏感性、特异性均较高,文献报道FTA-ABS 对各期梅毒检测的特异性达到 92% ,对一期梅毒敏感性为80%,二期为99% ~100%,三期为95%~ 100%,亦常被用做确证试验。FTA-ABS-19S-IgM试验是先将血清中 IgG 和 IgM 分离,再用 FTA-ABS 法检测 19S-IgM 抗体,避免了母体 IgG 的干扰,常用于新生儿先天梅毒血清学的诊断试验,是早期确诊先天梅毒的重要手段。其缺点在于步骤繁琐,操作费时,结果判读易受操作人员经验的影响。
2. 2. 4 快速乳胶凝集试验( syphilis fast test) : 本试验是将梅毒螺旋体 TpN15、TpN17 与 TpN47 重组抗原结合到乳胶颗粒上,当血清中存在特异性梅毒螺旋体抗体时,即可发生凝集反应。其与 TPPA 一致率可达98. 8% ,有一定的敏感性和特异性。该试验操作简单、快速,适合门诊梅毒检测。
2. 2. 5 梅毒螺旋体免疫印迹技术( WB) : 该法将免疫学的特异性和分子生物学的灵敏性相结合,具有敏感性高、特异性强的特点。Byrne 等用免疫印迹法检测梅毒螺旋体抗体时,认为只有当 15. 5、17、44. 5、47 kDa 4 个抗原中的 3 个被检测到才能判断为阳性,其敏感性为 98%,特异性为 100%。诊断梅毒的灵敏性优于 FTA-ABS 约 3 ~4 个血清稀释度。对神经性梅毒检测的阳性率为 100%。此法操作简便,特异性好,结果易判,但成本较高。
2. 2. 6 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验( TP-ELISA) :是将梅毒螺旋体 TpN15、TpN17 与 TpN47 重组抗原包被在微孔板上,采用双抗原夹心法检测梅毒螺旋体特异性抗体。其原理是利用包被的梅毒特异性抗原对血清中的抗体进行初筛,然后通过酶标记的特异性抗原再次进行筛选,因此增加了结果的特异性。该法可同时检测 IgM、IgG 抗体,缩短了窗口期,提早了对感染后的检出,特别是 TP-IgM 对早期梅毒、先天梅毒的诊断有重要意义。文献报道 TP-ELISA 方法的敏感性高于荧光密螺旋体抗体吸收试验( FTA-ABS),对一期梅毒的诊断灵敏度为 93. 8%,且生物学假阳性和假阴性发生率明显低于 RPR。该方法操作简单,易于自动化,适合大批量样本检测,结果准确可靠,被公认为梅毒血清学诊断试验的首选方法。
2. 2. 7 梅毒胶体金法( ICS) : 金标法是一种快速体外诊断技术。应用基因重组技术制备梅毒螺旋体特异性基因工程抗原,采用胶体金标记和免疫层析技术,能够高度特异的检测待测血清中的抗体。可用于全血、血浆、血清的检测,灵敏度高,可用于梅毒的快速检测和相关筛查。胶体金法检测 TP-IgM 还可用于诊断梅毒复发和再感染的检测。
2. 2. 8 化学发光法( CMIA) : 将 TP 抗原包被到固体铁粒子上,使其与标本中的抗 TP 抗体反应,再与酶标抗人 IgG 抗体结合,形成抗原-抗体复合物后,加入化学发光基质,根据化学发光基质的发光量可计算出标本中抗 TP 抗体的含量。Knight 等报导应用此法检测梅毒患者血清有很好的敏感性( 95. 8% ~100%)和特异性( 99. 1% ~100%) 。但由于试剂成本较高且需要特殊仪器,目前未在临床得到广泛应用。
3、 分子生物学技术
随着分子生物学技术的飞速发展,应用 PCR 技术检测梅毒螺旋体 DNA 已在临床得到应用。现 PCR 诊断梅毒的方法主要有常规 PCR、多重 PCR、实时荧光定量 PCR、RT-PCR( 反转录 PCR) 、巢式 PCR。Liu等应用 PCR 技术检测生殖器溃疡标本 polA 基因,敏感性为 95. 8%,特异性为 95. 7%。Leslie 等应用实时荧光定量 PCR 检测患者标本 polA 基因,敏感性为 80. 39%,特异性为 98. 40%。PCR 技术敏感性高,但存在难于标准化的问题,其原因主要是由于引物来源不同以及各实验室间 DNA 抽提方法存在差别,且临床标本成分复杂,也进一步导致了该法难于标准化。
所以建立对梅毒螺旋体高度特异的 PCR 方法尤为重要。PCR 技术是梅毒血清学试验的有益补充,在早期梅毒诊断中发挥重要作用。
综上所述,应根据研究目的选择恰当的试验方法。
目前,国内实验室在进行梅毒常规筛查及疗效观察、判断复发及再感染时常采用梅毒非特异性血清学试验( RPR、TRUST 等) ; 各期梅毒的确诊试验常采用梅毒的特异性血清学试验( TPPA、TPHA 等) ; 进行大规模梅毒筛查常采用双抗原夹心法 ELISA。随着检测技术的迅速发展,必将提供给更加简便、快速、准确、低成本的梅毒诊断试剂,使梅毒患者得到早诊断、早治疗,从而全面控制梅毒的流行。
参考文献:
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