奇妙的自然界中生活着一群恐怖的 “吸血鬼”,有人们所熟悉的吸血动物,如按蚊、水蛭和血吸虫等,也有令海洋中的 “吸血鬼”七鳃鳗。它们不仅依靠吸食动物和人类的血肉为生,而且还会传播慢性或致命疾病,给社会经济和人类健康带来极大危害。随着人类和多种模式生物全基因组测序和基因功能注释的逐步完成,庞大的基因组信息被源源不断地挖掘出来,人们逐渐找到了预防和诊断这些疾病的方法,也在吸血动物的唾液腺中找到了一些具有抗凝、镇痛以及抗炎等功能的活性成分。但是单纯基因组信息并不能完全解决相关疾病的困扰,因为基因只是遗传信息的携带者,蛋白质才是机体生理功能的最终执行者和疾病发生的核心。与相对稳定的基因组不同,在内外环境的作用下,蛋白质组总是处于动态变化过程,所以研究全部蛋白质表达谱才能确切阐明细胞的生理功能状态及疾病的病理演进过程。因此,对吸血动物蛋白质组学的深入研究将有助于了解吸血过程中相关蛋白质的变化情况,发掘功能蛋白,阐明疾病传播的机制,为特异生物标志物和治疗靶点的筛选和鉴定提供有效依据。综述了吸血动物蛋白质组学的主要研究内容和手段,以及吸血过程中各组织蛋白质组的动态变化及其潜在的临床应用意义。
1、吸血类动物蛋白质组学的主要研究范畴及手段
吸血类动物蛋白质组学的主要研究范畴包括3个方面:功能蛋白质组学:主要是对吸血类动物唾液腺中的活性蛋白质组分进行鉴定并详细阐述其主要功能;差异蛋白质组学,即比较蛋白质组学:比较吸血类动物在生理和病理过程中蛋白质组的表达变化;相互作用蛋白质组学:主要是研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用,绘制某个体系的蛋白质间相互作用和联系的网络图谱(图1)。其中,差异蛋白质组学是研究吸血类动物蛋白质组学的重点。目前,蛋白质组学研究的主要手段有:以双向凝胶电泳为核心的蛋白质组分分离技术和以质谱为代表的蛋白质组分鉴定技术,以及蛋白质组生物信息学等。
吸血动物从寄主血液中汲取营养并传播疾病,它们的唾液腺、中肠、血液和排泄分泌物中可能含有一些致病分子,以及一些具有抗凝、镇痛、免疫防御等功能的活性成分,作为其对抗天敌的重要武器。其中部分活性物质已经应用于临床疾病的治疗 (如:水蛭素、吸血蝠唾液酶)。
2、吸血类动物唾液腺蛋白质组学研究
吸血动物为了成功从宿主吸取血液需要克服一系列障碍:必须刺穿皮肤,快速完成吸血过程,逃避宿主的排斥反应以及抑制宿主的凝血、疼痛和炎症反应等等。它们的唾液腺应含有一些具有抗凝等功能的活性成分,如血小板聚集抑制因子、抗凝因子、血管扩张因子等。
这些活性成分将有助于保证吸血动物吸血过程的顺利进行。
2.1按蚊唾液腺蛋白质组学研究
唾液腺是按蚊的重要器官,不仅有助于消化摄入的糖分及血液,同时也能传播疾病并引起局部的变态反应。
2012年Narissara等人通过SDS-PAGE电泳分析发现:按蚊 (Anopheles barbirostris)在叮咬期间、吸血中,以及吸血后,其唾液腺蛋白质组分的表达水平发生下调,甚至消失。这些表达水平发生改变的蛋白质组分包括:组胺结合蛋白 (Long form D7),血管舒张剂 (Peroxidase),凝血酶抑制剂 (Serpin protease inhibitor)、抗血小板凝集因子 (Anopheline antiplatelet protein)、免疫调节剂 (Adenosine deaminase)等。这些活性组分可通过吸血过程流入到宿主体内从而抑制宿主的凝血及炎症反应等,并传播病原体。
2012年,WASS等对按蚊唾液腺的抽提物进行了胰蛋白酶酶解,然后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)对其肽段进行了鉴定。序列分析结果表明按蚊唾液腺除了含有能够抑制宿主凝血过程所需的活性蛋白质或多肽,如抗凝血 (Serpin超家族蛋白)、抗血小板聚集 (Apyrase)和血管舒张因子 (Tyrosinase)等生物活性成分,还含有抑制宿主免疫防御的蛋白质,如腺苷脱氨酶 (Adeno-sine deaminase,ADA)等。它能够通过水解腺苷为次黄苷从而抑制炎性细胞因子的产生,最终起到免疫逃逸的作用。然而,由于按蚊唾液腺蛋白质含量较低,目前的研究多集中于与吸血相关的蛋白质的生物功能上。
2.2水蛭唾液腺蛋白质组学研究
水蛭具有多种药理活性,其应用前景非常广阔。
2004年,Baskova等首先运用蛋白质组学技术对欧洲医蛭 (Hirudo medicinalis)唾液腺分泌物进行了分析鉴定。研究发现欧洲医蛭唾液腺分泌物中共含有100多种蛋白质,通过质谱鉴定和生物信息学分析发现水蛭唾液腺分泌物中除了含有熟知的水蛭素(Hirudin)以外,还含有多种生物活性成分:如类胰蛋白酶抑制剂 (Tryptase inhibitor)、胰蛋白酶抑制剂 (Trasylol)、乳清酸 (Saratin)、溶菌酶 (Destabilase-lysozyme)、透明质酸酶 (Hyaluronidase)、胶原诱导型血小板聚集抑制剂 (Calin)、谷酰基转肽酶 (γ-Glutamyl transpeptidase)、凝血因子Xa抑制剂 (Antistasin)、血小板糖蛋白拮抗剂 (Decorsin)以及能够降解血栓 (富含血小板)的蛋白 (He-mentin)等。2007年,Baskova等利用双向电泳和质谱技术对不同季节不同月份的欧洲医蛭唾液腺分泌物进行了分析和鉴定。研究发现,欧洲医蛭唾液腺组分中抗凝血酶活性随季节发生改变,冬季活性最强,且水蛭素只有在冬季才能被检测出来。
2012年,Abbas等对不同月份的马来西亚水蛭 (Hirudi-naria Manillensis)进行了蛋白质组学比较分析。研究发现:在5月,马来西亚水蛭唾液腺的抗凝血酶活性最强,最弱是在11月至1月。因此,作者认为:
不同种属水蛭唾液腺组分不同并且会随着外界环境、时间的变化而发生变化;水蛭体内能产生抗凝活性成分以帮助水蛭吸取寄主血液并储存在体内,且不会发生凝血反应。除此之外,在水蛭的蛋白质组学研究过程中,还有很多低分子量多肽组分尚未被分离和鉴定,亟待进一步的分析与研究。采用蛋白质组学技术手段深入研究水蛭唾液腺的蛋白质组分可为阐明水蛭的药理学活性和作用机制奠定基础,具有较好的市场开发应用前景。
2.3蜱类唾液腺蛋白质组学研究
唾液腺是蜱类体内最大的器官,能够维持体内离子、水分平衡,抑制寄主的凝血反应,并传播各类疾病。有文献报道,蜱类唾液腺组分中含有大量的抗凝血分子 (Tcik anticoagulant peptide)、抗血小板聚集分子 (Triplatin)、层粘连蛋白 (Laminin)、蛋白酶抑制剂 (Serpin protease inhibitor)、蛋白酶(Aminopeptidase、Carboxylesterase、Adipose triacylglyceride lipase、Superoxide dismutase),以及免疫调节分子 (Thioredoxin)和神经麻痹毒素 (HT-1、HT-2、HT-3)。因此,深入研究蜱类唾液腺蛋白质组成员可为探索蜱类相关传染病的传播机制和寻找新型生物制剂提供重要的理论基础。
2005年,Lu等采用生物化学和蛋白质组学等多学科交叉的前沿方法,对不同发育期的长角血蜱 (Haemaphysa-lis longicornis)唾液腺蛋白质含量与成分的动态变化进行了比较分析。研究发现雌性长角血蜱唾液腺在饥饿期蛋白质含量最低,吸血初期含量明显升高,到交配期达到最大值,饱血后蛋白质含量开始下降,到饱血后第4天急剧下降至原始水平。这一变化趋势与雌蜱的附着、吸血、交配和饱血等寄生期的特点相一致。此外,经过多次重复实验Lu等发现凝胶上有6个蛋白点在不同发育时期表达模式不同,可以分为两类:第一类蛋白质表现为在饥饿期和吸血期不存在,在交配期开始出现,在饱血期当天表达量增至最大。第二类蛋白质表现为在饥饿期存在,在吸血期表达水平发生上调,在交配期表达量增至最大,饱血期含量开始下降。质谱鉴定结果显示第一类蛋白质为:热激基因转录调控因子 (COG1420)、琥珀酰-辅酶A合成酶β亚基和一种与产热有关的蛋白质 (CG17514,isoformA);第二类蛋白质为:丝氨酸蛋白激酶 (Serine protein kinase)、免疫球蛋白 (Similar to Drosophila melanogaster PebⅢ)和依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ亚基。后续功能实验结果表明所有这些蛋白质表达水平的变化都与蜱类吸血过程密切相关。然而不足的是所鉴定的差异蛋白点只是少数含量相对丰富的蛋白质。因此,还迫切需要鉴定蜱类唾液腺中的低丰度蛋白质以进一步阐明蜱类吸血及传播疾病的分子机制。
3、吸血动物中肠蛋白质组学研究
3.1按蚊中肠蛋白质组学研究
携带有疟原虫的蚊子在吸食人血的过程中会传播疟疾。疟原虫在侵染按蚊时,其雄性和雌性的配子细胞会在按蚊的中肠内完成受精过程并形成合子。因此,1998年Prevot等在研究疟原虫侵染按蚊机制的时候,把中肠作为重点研究对象,对疟原虫侵染不同品系的按蚊中肠做了蛋白质组学分析,试图在其中肠中筛选参与调控疟原虫卵囊黑化作用的关键蛋白质。研究结果表明,按蚊在被疟原虫感染之前,其疟原虫易感品系和抗性品系中肠组织的双向电泳图谱差异较小;但是,按蚊在被疟原虫感染之后第3天,其疟原虫抗性品系中肠的双向电泳图谱出现了一条分子量约为67kDa的蛋白条带,且该蛋白质浓度随着感染时间的延长而增加,而其易感品系的双向电泳图谱却没有发生明显变化。质谱鉴定此蛋白质为前酚氧化酶 (Prophenoloxidase,PPO),能够通过介导卵囊黑化包裹反应从而激活按蚊的先天性免疫防御系统。
2000年,Chun等采用冷激或注射等手段刺激疟原虫易感和抗性品系的按蚊,并对其中肠双向电泳图谱中发生差异表达的蛋白点进行鉴定,发现刺激后按蚊丝氨酸蛋白酶 (AgSpl4D1)的表达水平发生上调。序列分析结果表明该蛋白质与果蝇的脂酶和烟青虫的酚氧化酶极为相似。后续功能实验结果证实AgSpl4D1能够通过诱导按蚊体液分泌黑色素,并协同具有细胞毒性的醌类中间产物沉积到入侵的病原体周围,从而起到隔离杀死病原体的作用。此外,Prevot等研究发现雌按蚊和雄按蚊在添食糖水后,其中肠双向电泳图谱差异很小;而在添食血液后,雌按蚊中肠双向电泳图谱比雄按蚊多出8个特异性蛋白点。质谱鉴定结果显示这8个特异性蛋白点能够参与雌按蚊的吸血、免疫防御和炎症反应,并在繁殖等生理过程中发挥重要作用。目前,已有研究团队陆续采用蛋白质组学手段从疟疾传播媒介-按蚊体内大规模高通量筛选出与疟疾传播相关的特异性抗原成分,随后利用分子及免疫技术制备降低蚊虫生存力和生育力的疫苗,从而达到阻断蚊虫传播疾病的目的。
3.2扇头牛蜱中肠蛋白质组学研究
蜱类疫苗被认为是控制蜱类吸血和相关疾病传播最为有效的方法。目前市面上商业化的疫苗仅有两种,主要成分是蜱类中肠膜的重组蛋白 (TickGard和Grave)。蜱类中肠不仅能快速消化血液,还具有极强的抗病能力。因此,对蜱类中肠蛋白质组学的深入研究能够为疫苗的开发提供更为重要的理论依据。
2009年Kritaya等对扇头牛蜱(Rhipicephalus sanguineus)的 中肠进行了蛋白质组学研究,共发现134种蛋白质,并按生物学功能对其进行了分类 (图2)。此 外,在吸血过程中其中肠双向电泳图谱含有15个分子量相同、pH值不同的蛋白质。Kritaya认为这15个蛋白质为同种蛋白质的不同亚型。质谱鉴定和后续功能实验结果表明这15个蛋白质与能量代谢和蛋白质的折叠戚戚相关。它们分别是3种乙醛脱氢酶 (Aldehyde dehydrogenase)、3种蛋白质二硫键异构酶(Protein disulfide isomerase)、3种泛醌-细胞色素C(ubiquinol-cytochrome c)、2种ATP5A1综合酶(ATP synthase H+transporting atp5A1)、2种内质网驻留蛋白 (Endoplasmic reticulum resident pro-tein 29-like),以及3种细胞膜孔蛋白 (Porin)。这些蛋白质被认为是蜱类疫苗的潜在作用靶点,可利用RNA干扰等技术控制蜱类食物消化和病原体繁殖等生命过程。
4、吸血动物血液蛋白质组学研究
血液中富含多种蛋白质组分。在某些病理状态下,机体会分泌一些关键调节蛋白质或应激蛋白质到血液中,最终导致血液中总蛋白质成分发生质或量的变化。因此,比较分析正常与异常状态下血液的蛋白质表达图谱,寻找发生差异表达的蛋白点并进行结构和功能鉴定,最终获得相应的生物标志物和(或)药物作用靶点,已成为疾病监测、新药开发、药理毒理学研究的重要手段。
按蚊血液中富含的血淋巴就是其重要的非特异性免疫器官,对多种病原物具有很强的抵抗能力。为了从中找到一些具有广谱抗菌或抗病毒等活性的成分,2005年Paskewitz等人利用双向电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS)的方法对疟原虫侵染前后的按蚊血液进行了蛋白质组学的研究。研究发现,按蚊血液的双向电泳图谱约含有280个蛋白点,对其中丰度较高的28个蛋白点进行了分析鉴定,共获得了26个不同的蛋白质的序列。分析结果表明这些蛋白质主要参与按蚊的免疫调节反应、离子转运和脂类的生理代谢等活动。按蚊在感染细菌后,其血液中的酚氧化酶和两个类几丁质酶的表达水平明显发生上调。后续功能实验结果表明该蛋白酶主要通过参与黑化包裹疟原虫的过程从而起到抵抗病原物的作用。此外,血液中转铁蛋白等的表达水平则发生明显的下调,推测与按蚊体内铁稳态的调节密切相关。由于血清中富含多种蛋白质组分,因此,若在复杂的血清组分中发现针对相关疾病的靶标分子,可对疾病的诊治起事半功倍的效果。
2010年Shen等利用蛋白质组学方法从日本血吸虫成虫血清内筛选出4种蛋白质:亮氨酸氨基肽酶 (SjLAP)、果糖二磷酸醛缩酶 (SjFBPA)、26kDa谷胱甘肽转移酶 (SjGST)和22.6kDa血吸虫表膜主要蛋白 (Sj22.6)。其中,SjLAP和SjFBPA可作为指示工具去诊断慢性血吸虫病。
2011年Chaerkady等研究发现,按蚊受到机械性伤害后,一些不含信号肽的代谢相关酶类 (淀粉酶、水解酶、脂酶、胰蛋白酶)会发生上调反应。因此,采用蛋白质组学研究手段可于短时间内从整体水平获得大量表达水平发生改变的蛋白质,为今后研究微生物感染按蚊的机制提供了良好的参考。
5、吸血动物排泄分泌物蛋白质组学研究
吸血动物在寄生过程中通常会向宿主体内排泄、分泌一些能够干扰宿主免疫反应过程的活性分子,从而使其可以逃脱宿主的免疫攻击。因此,开展对吸血动物排泄分泌物蛋白质组学的研究,将有助于了解免疫逃避分子机制,研制新的预防疫苗和新的诊断方法。
血吸虫在终末宿主体内完成其生活史的过程中,可通过其体表、肠上皮表面或者是其它器官释放分泌物,以免疫模拟方式来干扰宿主免疫系统的攻击。血吸虫寄生于人畜体内会严重危害人畜健康,而目前市面上可治疗的药物只有吡喹酮 (Praziquantel),但该药物对重复感染束手无策,亟需改善。采用蛋白质组学技术高通量筛选并鉴定血吸虫排泄分泌物中的蛋白质组分不仅有助于揭示血吸虫调节宿主免疫应答反应、建立慢性感染的机制,还为筛选抗血吸虫感染的疫苗候选分子,药物靶标和诊断抗原提供理论依据。到目前为止,已有大量文献报道日本血吸虫 (Schistosoma japonicum)各个发育时期排泄分泌物蛋白质组学的研究。
2004年,Curwen等对曼氏血吸虫 (Schistosoma mansoni)的尾蚴、童虫、成虫、未成熟卵,以及成熟卵进行了可溶性蛋白质组学分析,并成功鉴定出84种蛋白质。这些蛋白质主要在细胞运动,蛋白折叠、修饰和合成,核酸合成,信号转导、肌肉发育,以及电子传递等方面发挥重要作用。差异蛋白质组学分析结果显示各虫体阶段共同表达的蛋白质比发生差异表达的蛋白质含量高。
这些高丰度的蛋白质分别是谷胱甘肽转移酶、脂肪酸结合蛋白,以及腺苷酸激酶。它们在血吸虫的传播及发育过程中发挥重要作用。
2009年Feng等人采用蛋白质组学手段研究发现日本血吸虫尾蚴的排泄分泌物中含有Actin等结构肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等能量代谢相关酶类、14-3-3蛋白等信号传导通路相关分子、HSP70家族等相关热休克蛋白,以及20s蛋白酶体等五类功能蛋白。序列分析和后续试验证明这些成分有利于尾蚴以皮肤渗透方式入侵宿主,并逃避其体内的免疫反应。在血吸虫童虫时期,排泄分泌物中的组分则主要参与机体细胞代谢、应激反应,以及生长发育等过程。2009年Liu等在日本血吸虫成虫的排泄分泌物中鉴定出大量的脂肪酸结合蛋白 (Fatty acid binding protein)和少量的热休克蛋白 (HSP70、HSP90、HSP97)、肌动蛋白、微管蛋白、氨肽酶 (Aminopeptidase)、烯醇化酶 (Enolase)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶等。后续分析结果表明这些蛋白质在调节宿主免疫反应中发挥着重要作用。此外,2009年Steinfelder等还在日本血吸虫虫卵的排泄分泌物中发现了高丰度的、能特异性引起Th2细胞极化的糖蛋白 (Omega-1)。除此之外,抗菌蛋白 (CAP18)、硫氧还蛋白过氧化物酶 (Thioredoxin peroxidase),分子伴侣 (Heat Shock Proteins)和信号通路相关蛋白 (14-3-3蛋白、GTP-结合蛋白、肌钙网蛋白)等也同时被鉴定出来。这些结果为进一步阐明血吸虫的致病机制提供了重要的信息,为下一步阻断或抑制血吸虫的发育传播以及缓解病情奠定了坚实的理论基础。
6、吸血动物口腔腺蛋白质组学研究
七鳃鳗 (Lampetra japonica)是迄今所知的最原始的无颌类脊椎动物,是研究适应性免疫系统起源与进化,系统发育的优良动物模型。此外,七鳃鳗还具有非常特殊的半寄生生活方式,即依靠吸食宿主鱼体的血肉为生。Li等人根据已构建好的七鳃鳗口腔腺cDNA文库成功克隆出七鳃鳗吸血过程中的重要功能基因,如富含半胱氨酸分泌蛋白 (Cysetine rich secretory protein)、具有纤维蛋白原水解酶活性的BGSP-1(Buccal gland secretion protein-1)、Peroxiredoxin(Prx),含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽序列 (Arg-Gly-Asp,RGD)等。然而目前国内外尚无关于七鳃鳗蛋白质组学的研究工作。
本课题组拟率先采用蛋白质组学技术手段分析七鳃鳗的口腔腺、血清、髓样,以及肝脏等组织。大规模、高通量的筛选鉴定一些与其组织器官的系统发育,适应性免疫系统起源,以及与抗凝、抗炎和镇痛等功能相关的关键蛋白质,这将为海洋生物资源的保护与开发以及新型药物的研制带来极大的推动作用。
7、展望
随着人类基因组计划 (Human Genome Project)的完成,生命科学研究已进入后基因组时代,其标志之一就是蛋白质组学 (Proteomics)的兴起。蛋白质组学作为重要的实验技术,已经成为人们筛选重大疾病的特异生物标志物和研究发病机理的新途径。对吸血动物的唾液腺、中肠、血液、排泄分泌物,以及口腔腺等组织进行蛋白质组学研究不仅有助于寻找和筛选具有特殊功能的生物活性分子,还为阐明某些因寄生行为而引起的疾病的致病机制奠定良好的理论基础。这可为今后应用于寄生动物引起的疾病的预防、早期诊断、临床治疗和疫苗研发等方面提供有利的数据支撑。
虽然运用蛋白质组学技术,研究人员已从吸血动物的唾液腺、中肠、血液、排泄分泌物,以及口腔腺等组织中发现了大量的生物活性成分以及一些引起疾病的关键分子,但是还有很多低丰度的功能蛋白质仍未被鉴定出来。发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台仍是今后相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。相信随着蛋白质组学技术的不断发展,国际间的学术合作及资源交流的不断加强,全球共享数据库系统的不断完善,越来越多的低丰度重要功能分子将被挖掘出来,为人类健康提供更有价值的理论参考。
