人胚肺二倍体细胞来源于人胎儿组织,具有正常的生物活性和功能性,对多种病毒敏感,而不诱发癌变,多用来培养病毒和制备疫苗。随着科技的发展,更多的疫苗制品启用二倍体细胞作为生产疫苗基质。其安全性及疫苗的免疫原性都有所提高。如水痘减毒活疫苗、甲肝疫苗常用的二倍体细胞株有2BS、MRC-5、KMB-17等。
采用人体同源的细胞作为细胞基质,疫苗质量逐渐上升,在免疫效果和安全性上都有所报道。由于人胚肺二倍体细胞生物学特性稳定,在延缓衰老药物,病毒研究,医学方面也得到了广泛应用。本实验通过对人胚肺二倍体细胞2BS株在两种培养瓶中的培养特性比较,选择更适合二倍体细胞生长的培养瓶,提高细胞质量和利用率,为各项研究提供优质的细胞。
1 材料与方法
1.1 细胞株
人胚肺二倍体细胞2BS株:27代,由长春祈健生物制品有限公司研究室提供,批号为20120320。
1.2 细胞培养瓶
玻璃方瓶(培养面积35cm2)由四川万福玻璃仪器有限公司提供,T75培养瓶(培养面积75cm2)由美国Thermo公司提供。
1.3 主要试剂和仪器
MEM培养基(美国实验室有限公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);谷氨酰胺(武汉大华伟业有限公司);碳酸氢钠(北京化工厂);恒温培养箱(日本三洋电器股份有限公司);倒置显微镜(重庆光学仪器厂),pH剂(上海精密仪器有限公司)、细胞计数仪(美国Inno-Alliance Biotech公司)。
1.4 细胞复苏和连续传代培养
从液氮取出保存二倍体细胞冻存管置于40℃水浴速溶。迅速将细胞混合均匀后以相同的接种浓度分别接种于T75培养瓶和玻璃方瓶中,并补足相应的细胞复苏液,置于37℃恒温培养箱中进行培养。
16—24h换复苏液后继续培养,并观察细胞生长状态。细胞培养至单层后,对细胞培养液进行PH测定。并经胰蛋白酶消化后,加入生长液吹打至细胞脱落混合均匀后细胞计数,按1:4比例连续传代培养。观察记录各代次细胞的生长状态及其它指标。
2 结果
2.1 细胞生长状态比较
细胞传代后显微镜观察比较,T75培养瓶细胞长势明显优于玻璃方瓶。细胞贴壁迅速,分裂速度快,细胞密度大,胞质相对饱满。
T75培养瓶内细胞前58代3天均可形成单层,细胞无明显差异。当细胞传代至58—68代时,细胞贴壁和增殖能力减弱,细胞表面有颗粒存在,,单层时间延长。68代以后,细胞急剧衰退。72代细胞呈网状,不易成片无法单层。见图1。【图1】
玻璃方瓶内细胞前48代3天均可形成单层,细胞生长状态无明显差异。当细胞在50—58代传代过程中,细胞贴壁和增殖能力减弱,细胞变暗,细胞表面有颗粒存在,单层时间延长。60代细胞呈网状,不易成片,无法单层。见图2。【图2】
2.2 细胞计数
细胞传代培养72h后,对两种培养瓶内细胞经胰酶消化后,生长液稀释10倍细胞计数比较,相同代次T75培养瓶单位面积细胞数明显多于玻璃方瓶。T75培养瓶内细胞58代数量无明显差异,58代以后细胞数开始减少;玻璃方瓶内细胞48代数量无明显差异,48代以后细胞数开始减少;见表1。【表1】
两种培养瓶单位面积各代细胞计数:
2.3 PH 值变化
细胞传代72小时后,两种培养瓶内生长液PH测量比较,T75培养瓶内58代前液体PH值无明显差异,58液体PH值升高明显。玻璃方瓶内48代前液体PH值无明显差异,48代后液体PH值升高明显。见表2。两种培养瓶中培养液PH变化:【表2】
3 讨论
19世纪60年代人胚肺二倍体细胞株的建立,国内外对二体细胞的研究进入了一个新的阶段,在多个领域得到广泛的应用,由其为疫苗生产疫苗提供了良好的细胞基质。WHO对二倍体细胞在疫苗生产有着严格的要求,应经国家质控当局的批准和注册。制备疫苗用人二倍体细胞不得超过细胞总平均寿命三分之二群体倍增的代次。所以延长二倍体细胞寿命,维持生物学特性稳定,才能充分利用二倍体细胞,提高细胞质量,生产出安全有效的疫苗。
随着生物技术的不断发展,疫苗的生产工艺不断改进,目前国内疫苗企业正逐步淘汰传统的转瓶生产工艺进行细胞工厂培养,乃至生物反应器的规模化应用。本研究通过比较人胚肺二倍体细胞2BS株玻璃瓶和T75培养瓶两种容器下培养,并进行极限传代。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数,PH值测定等比较两种容器培养的二倍体细胞的培养结果。2BS细胞在两种培养瓶内极限传代,当达到一定代次时,2BS细胞形态发生变化,增值能力减弱,代谢缓慢。但在T75培养瓶内连续传代,细胞贴壁迅速,分裂速度快,细胞密度大,提高传代代次,并延长细胞寿命,能更好的维持细胞生物学特性。T75培养瓶在使用过程中不用高压灭菌处理,可以直接使用,方便快捷,操作简单。减少人力。
参考文献
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