骨髓间充质干细胞是一类非造血干细胞，来源于中胚层，具有多分化潜能，具有自我更新能力，易于分离培养，体外增殖能力强的特点。骨髓间充质干细胞在体内发挥调节免疫，减轻炎症反应，组织再生，损伤修复，维持内环境稳态的作用.
在进行自体移植方面具有安全，无致瘤性，无组织配型和免疫排斥的问题，因而成为组织工程与再生医学研究的焦点。种子细胞是组织工程的关键因素之一。骨髓间充质干细胞可以分化为骨细胞，软骨细胞，肌腱，肌肉细胞，成纤维细胞，脂肪细胞，肝细胞，甚至神经元细胞。为结缔组织等相关疾病中的骨、软骨、肌腱等的损伤修复提供了潜在的细胞来源，被认为是骨组织工程中有价值的种子细胞.hMSCs 的成骨定向诱导可为骨组织工程技术治疗大段骨缺损提供种子细胞，满足其在种子细胞数量和质量上的需要。实验通过全骨髓培养法分离hMSCs,并用诱导分化培养液做定向诱导培养，观察 hMSCs 向成骨细胞分化过程中的细胞形态学变化，进行成骨细胞生物学表型鉴定以探讨 hMSCs 的培养方法、生长规律及向成骨细胞分化的条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1 试剂及细胞
培养基 α-MEM,0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA,L-谷氨酰胺，青霉素/链霉素双抗，胎牛血清（FBS），Trizol 裂解液购自公司；四氮唑蓝（MTT），茜素红 S,β-甘油磷酸钠，地塞米松和维生素 C,蛋白质裂解液 RIPA 购自Sigma 公司；碱性磷酸酶活性检测试剂盒，购自CellBiolabs公司；逆转录试剂盒购自Qiagen公司，引物由 Invitrogen 公司合成；抗体 RUNX2,BMPR2,GAPDH 购自 Cell Signaling 公司。人骨髓间充质成体干细胞第一代传代细胞由Gene Therapy 提供。
1.1.2 成骨诱导培养基
基础培养基（内含体积百分比为 16.5%的胎牛血清+α-MEM+1%青霉素/链霉素+2 mM L-谷氨酰胺），加入 20mM 的 β-甘油磷酸钠，10nM 地塞米松，100μM 维生素 C 配制成成骨诱导培养基。
1.2 方法
1.2.1 数量为 1×的细胞接种于直径为 10cm 的培养皿中，用含 16.5%FBS 的 α-MEM 培养液，于37℃，5%CO2,饱和湿度>95%的 CO2 培养箱中培养，3~4 天细胞达到 80%融合时用 0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA 消化传代。根据实验需要重新接种在合适培养瓶或培养皿中。6 孔板中用于钙结节染色分析，96孔板中用于MTT实验和碱性磷酸酶（ALP）检测，10cm 直径培养皿用于提取总 RNA 和蛋白质，分别用于 RT-PCR 和蛋白质印迹实验。诱导分化培养组（实验组）加入诱导分化培养液，基础培养组（对照组）加入等量基础培养液，每 3 天换液一次。
1.2.2 细胞观察
倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖、细胞形态变化及钙盐沉积。
1.2.3 细胞矿化作用检测 用 4%甲醛固定细胞min,1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，1%饱和茜素红染色 30min,观察细胞的形态和染色结果。
1.2.4 碱性磷酸酶（ALP）活性测定 采用StemTAG 碱性磷酸酶活性检测试剂盒测定ALP活性。
等描述的方法为先将细胞用预冷的 1×PBS 冲洗，加入试剂盒中的细胞裂解液，4℃孵育 10min,转入离心管内 12 000 转/min 离心 10min,定量蛋白浓度，取 50μl 裂解液转入 96 孔板，加入 50μStemTAG 碱性磷酸酶活性测定底物，37℃孵育20min,加入 50μl 终止液。混匀 30s,以波长检测吸光度 A 值。
1.2.5 骨钙素（OCN）的测定
将细胞接种于 6 孔板内，诱导期末即（第 1,3,5,7,9,13,17,21 天）时，用 PBS 洗净孔内的培养液，加裂解细胞，按试剂盒的说明书进行操作，抽提总RNA.引物序列 OCN:上游引物 5'GCA AAG-3',下游引物 5' CAG-3';β-actin:上游引物 5'GAG CTG CG-3',下游引物 5'ACA TGG-3'.β-actin 作为内参，设置无模板的阴性对照。使用 Qiagen 试剂盒进行逆转录 cDNA 及RT-PCR,RT-PCR 反应在（Bio-Rad）测定仪中进行。预变性 95℃ 5mn,PCR 循环条件为： 95 ℃，30 s;65 ℃，30 s;72 ℃，2 min,共个循环，试验中 Ct 值进行三次重复检测。
1.2.6 蛋白质印迹实验
将 6-孔板中培养不同时间点的诱导成骨细胞组和对照组细胞，用预冷的PBS 冲洗三遍，加入细胞裂解液，超声处理 1min,10 000x g 离心 5min.裂解的上清液进行蛋白质浓度定量。蛋白质印迹实验按照 Cell signaling 公司说明书，6%~12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，电转膜100伏1h,5% （w/v）脱脂奶粉20 溶液室温封闭非特异性抗体 1h,一抗 RUNX2,BMPR2 和 GAPDH 按说明书 1:500~1 000 稀释，作为内参。印迹膜加入一抗 4℃孵育过夜，用0.1%Tween 20 缓冲液洗膜三次，每次 5min.印迹膜加入antibody 二抗，孵育 1h,用 TBS/0.1%Tween 缓冲液洗膜三次，每次 5min.在近红外成像系统Infrared Imaging System（观察蛋白质印迹图像及光密度软件定量分析条带灰度值。
1.3 统计学处理
实验数据均为三次独立实验的结果，数据用均数±标准差（standard deviation,SD）表示。组间差异比较选用单因素方差分析One-Way ANOVA,统计软件为（SPSS 13.0 版本），以 a=0.05 为检验水准，以（P<0.05）表明差异有统计学意义。RT-PCR 结果，应用公式-ΔΔ法计算OCN 表达量与第一天比较升高的倍数，△β,ΔΔCt = Δ- Δ.
2 结果
2.1 倒置相差显微镜下所见 人骨髓间充质干细胞 hMSCs 形态学观察，骨髓细胞接种于塑料培养瓶后，细胞在培养瓶中散在分布，核呈圆形，椭圆形，核仁多而明显。24h 后细胞贴壁，贴壁的细胞为单个，形态大部分呈梭形、三角形或纺锤形，培养天左右，细胞快速增殖，纤维细胞样，放射状排列生长（图 1）。
2.2 成骨诱导生长曲线分析（MTT 法） 第 3 代hMSCs 的生长曲线见（图 2）。成骨诱导组生长曲线呈 S 形，传代接种后第 1、2 天细胞增殖缓慢为潜伏适应期，从第 3 天开始细胞增殖加速，细胞数目呈指数级递增，此期为 hMSCs 的对数生长期。至第9 天达到顶点。随着诱导时间延长 13~21 天增殖变得缓慢，进入平台期。hMSCs 在成骨诱导培养基的作用下，逐渐向成骨细胞转化，但 HMSCS 仍具有增殖能力。
2.3 细胞诱导分化的矿化作用
传代培养中细胞加入诱导分化培养液，9d 后细胞长满培养皿底，并开始密集重叠生长，无接触抑制。10~21d,成骨诱导组可见重叠生长细胞逐渐形成较多散在的致密圆形矿化结节，随后胶原堆积及钙盐沉积，矿化结节逐渐增大，结节周围的细胞密度较高，轮廓不清，结节中心透光性差（图 3）。此时，基础培养作对照培养细胞虽密集重叠生长，但不形成矿化结节。
2.4 碱性磷酸酶ALP活性
成骨诱导 hMSCs 后 ALP的活性随诱导天数的增长逐渐增长，在诱导后的第9d 达到高峰，13~21dALP 活性有所减弱（图 4）。
2.5 RT-PCR 检测骨钙素 OCN 的相对表达量
成骨标志物 OCN 随诱导天数的增加逐渐增长，从第开始显著增长，一直持续到 21d.
2.6 蛋白质印迹 RUNX2 及 BMPR2 蛋白表达量在成骨诱导组随诱导天数增加表达逐渐加强。RUNX2 在诱导第 7d 显著增加，而 BMPR2 在诱导第 14d 显著增加。
3 讨论
研究表明，hMSCs 易于获取，可诱导分化为多种细胞,hMSCs 具有自我更新能力和组织修复功能，体内激素失衡及衰老引起的的 hMSCs 功能减退，失去成骨和软骨分化能力，可以导致骨质疏松和骨性关节炎的发生.hMSCs 在骨组织工程（Tissue Engineering,BTE）细胞替代治疗中有极其广泛的应用前景。但人体 hMSCs 含量稀少，仅占骨髓细胞的百万分之一.而组织工程需要大量的种子细胞，因此进行分离纯化和体外扩增就显得尤为重要。
McQuillan 等报道，β-甘油磷酸钠可以为骨细胞分化和增殖提供磷原子，能增加碱性磷酸酶在成骨细胞中表达，从而促进生理性钙盐沉积钙化。
还能够促进骨钙蛋白 mRNA 的表达以及蛋白分泌.地塞米松能提高碱性磷酸酶活性，诱导细胞表达骨钙素，增加Ⅰ型胶原和骨桥素信使核糖核酸的合成，诱导 BMSCs 向成骨细胞转化。维生素 C 促进体外培养细胞合成胶原，并调节碱性磷酸酶活性。
ALP 明显阳性表达是 hMSCs 早期向成骨细胞分化的重要标志.本研究从诱导培养的早期，第五天可以检测到 ALP 的活性，随培养时间延长反应逐渐增强。ALP 是成骨细胞分化系列中的最重要标记，也是参与骨钙化的重要蛋白之一。成骨细胞可通过基质小泡释放出钙离子，镁离子和 ALP 等物质，镁离子是碱性磷酸酶的激活剂，钙离子在 ALP 的作用下沉积在胶原上，完成基质矿化过程。在成骨细胞分化过程中，ALP 和骨桥蛋白 OPN 相继表达，而骨钙素 OCN 的表达始于骨钙化开始后。在成骨细胞表型形成过程中，OCN 的表达呈现发育阶段特异性，茜素红染色阳性表明在细胞结节形成时开始表达，基质矿化时达到最高水平。OCN、OPN 均属于比较重要的非胶原蛋白，在骨钙化过程中受到 RUNX2 的调节作用。
属于 RUNX 转录因子家族成员，RUNX2 参与成骨细胞分化与骨骼形成过程，通过结合在启动子或增强子核心元件部位调节骨发生的重要转录基因，包括 OCN、OPN 和骨唾液酸糖蛋白基因的转录,RUNX2 在促进骨膜和软骨的骨化，促进骨化中心成熟过程中起着重要作用.
BMPR2 是一类结合在一系列分泌性骨形成蛋白上的II 型丝氨酸/苏氨酸受体。BMPR2 属于 TGF-β配体超家族成员，可以调节软骨发生，骨细胞成骨过程，原肠胚的形成，神经元的形成等.BMP 结合在和 II 型丝氨酸/苏氨酸受体可以诱导 Smad1/5/8 磷酸化进而活化下游的靶基因而在骨形成中发挥重要作用。本实验采用β-甘油磷酸钠、Vit C 和地塞米松作为成骨诱导添加剂，诱导的细胞能够产生ALP,并具有矿化能力 OCN 的 mRNA 阳性表达以及蛋白质印迹实验 RUNX2 和 BMPR2 蛋白的表达证明我们诱导分化后的 hMSCs 具备成骨细胞的生物学特性。
综上所述，人的 hMSCs 在体外培养中增殖能力强，经体外诱导和分化的成骨细胞生长良好，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性，且周期短、重复性好，在骨组织工程中有良好的应用前景，为临床开展自体成骨细胞修复骨缺损奠定了基础。
