我们已报导了培养的哺乳动物细胞及其核在X线照射后电泳移动度(EPM)降低. EPM随着时间而降低,以照后4小时降低最为明显.小剂量照射,在照后保温24小时,有些细胞的EPM即恢复到正常.EPM的改变能完全被低浓度的疏基阻断剂、植物血凝素或刀豆素A所阻断.
本研究应用红细胞及其残骸,因其有以下优点:(1)红细胞缺核,残骸既缺核又缺细胞浆,这样可以研究细胞浆和细胞核两个主要成份在辐射导致的EPM改变中的意义;(2)培养的哺乳动物细胞的EPM主要决定于唾液酸、硫酸软骨索和透明质酸,而在红细胞,唾液酸是仅有的带负电荷的主要威分;(3)红细胞易于大量得到.
材料和方法.
红细胞是在实验前由穿刺大鼠心脏取得.红细胞残骸的制备是先将红郭胞在3℃低渗的巴比妥缓冲液中搅拌,溶解的红细胞用低渗巴比妥缓冲液清洗三次,然后悬浮在等渗的PBS中以恢复膜形.
体外照射红细胞及其残骸,观察100、250、5D0或3...伦照射后不同时间红细胞及其残骸的EPM.
单个细胞的EPM测定是用蔡氏细胞电泳装置(ZeissCytopherometer).电泳移动度按以下公式计算.
结果.
一、X线照射后EPM随时间的改变.
完整红细胞照后EPM随时间进行性地降低,以照后4小时为最明显,到照后24小时恢复,但恢复的程度与照射剂量有关.小剂量照射恢复较好,3000沦照射未.见恢复.
红细胞残骸如同红细胞一样,照后4小时EPM降低,但以后不论照射剂量多大皆不恢复.结果说明,不论有无核或细胞浆,辐射都可使EPM降低,而恢复则必需有细胞浆.非照射的红细胞在PBS中孵育24小时EPM可降低10%,而250或500伦照射的红细胞在PBS中观察不到EPM的恢复.
二、唾液酸含量.
用神经胺酶与红细胞孵育以除去唾液酸,使红细胞EPM降低60%.用透明质酸酶或软骨素酶处理对EPM则无影响.在照后4小时EPM降低最明显时测定红细胞残骸唾液酸含量,不论照射剂量多少,唾液酸含量都没有改变,说明唾液酸含量与EPM降低无关.
三、温度对EPM改变的影响.
红细胞在3OCPBS中照射500伦,照后在不同的温度条件下孵育4小时.EPM降低程度在22、3T'C范围内与温度的变化无关,在IOOC以下孵育EPM不发生改变.'
在10、20'C时EPM的降低与温度间有明显的依赖关系.非照射红细胞在不同温度的条件下孵育本身对EPM无任何影响.
四、离子强度对显现辐射效应的影响用于侧定EPM的磷酸缓冲液的离子强度对EPM值有影响.随着离子强度的增加,EPM不断降低.离子强度低于0.2x0.16了时,受照和对照的红细胞EPM的降低值相同,随着离子强度的增加,两者EPM下降的程度则有差别,受照红细胞较对照红细胞EPM下降得明显,离子强度在0.6x0.167以上时差别为最明显.按照Debye-Huckel公式,从离子强度可以计算离子雾(I.natm.sphere)的厚度.随着离子强度降低,离子雾厚度增加.
离子雾厚度=3.06(适用于水溶液)、(离子强度)'拭若用离子雾厚度作为近似地计算电动力学切变面(eleetrokinetiePlaneofshear),结果说明带阴电荷的基团(即唾液酸)从0、了.5埃的周边区错位至9.7、17埃的深层区.
讨论.
红细胞及其残骸的实验结果说明,就红细胞EPM的降低而言,细胞膜是X辐射的作用靶,细胞浆是照后EPM恢复的必要因素.
谷胧甘肤和ATP的加入可使EPM恢复,说明它们可能也参与恢复过程.但细胞膜对谷胧甘肤和ATP是不通透的,可能这些外源性物质的效应与其在细胞浆内的作用不同.
玛纱即"和Bide报导了照射使细胞内谷胧甘肤损失,但随后在37℃下孵育即能很快恢复,并与钾含量恢复直关.Suther飞"nd和Pill发现红细胞在有葡萄糖的条件下孵育时,膜琉基能重现,但红细胞残骸或无葡萄情时的红细胞则不能恢复.作为照后红细胞通透性改变的机理,Shapir.等提出胞膜发主了涉及琉基的构象改变.
照后EPM降低时唾液酸含量没有改变说明,细胞膜发生了局部改变.早有报导,受照射的培养哺乳动物细胞不释放唾液酸和硫酸软骨素.本实验EPM降低与温度的依从关系也支持局部改变的设想.植物血凝素受体的局部改变和膜成分重排也显示类似的温度依赖关系.照射反应在15℃左左有明显的改变是由于此时膜脂的流动性有变化.
EPM的降低能被SH一阻断剂和血凝素完全抑制,是与本设想相一致的.
用不同离子强度磷酸缓冲液测定EPM所得的结果为荷电基团错位提供了可靠的证据.普遍观察到随着离子强度的降低EPM增加.但是,从离子强度值难以确定电动力学的切变面的正确深度.荷阴电的糖是存在于双层脂外的亲水层中.假如我们设想离子自由地穿到亲水层,离子雾的厚度能给出一个电动力学切变面的近似估计.照后离子强度在0.10D以上时EPM降低这一事实提示唾液酸从周边区错位到较深层.
