一、 引 言
近年研究表明,表皮与真皮的相互作用,特别是角质形成细胞(human keratinocytes,HKC)与成纤维细胞(human fibroblasts,HFB) 的相互作用,在促进组织生长、维持组织内环境稳态、创伤愈合及瘢痕形成等方面具有极其重要的作用[1~4] .随着研究的深入,人们发现 HKC 影响 HFB 分泌胶原蛋白;反之,HFB 通过旁分泌的形式促进 HKC 增殖[5],这两种细胞的相互作用对伤口的愈合及再上皮化均有明显的调控作用[6,7].增生性瘢痕是人体皮肤创伤修复过程中的常见疾病,主要以成纤维细胞的过度增生及细胞外基质的过度沉积和降解不足为特征,严重影响患者的身体和心理健康.HFB 是创伤修复过程中真皮的主要功能细胞,近年来,HFB与增生性瘢痕的关系已成为研究的热点.
通过外部加压来抑制瘢痕形成的加压疗法自20世纪70年代以来在临床上得到了广泛的认可和应用,但是,其作用机理研究中有关压力下HKC 对 HFB 的作用研究相对较少.为此,我们通过自行研制的可控压力密闭细胞培养装置,初步探讨气体压力下HKC 上清液对 HFB 的生物学作用.材料和方法主要材料DispaseⅡ购自瑞士 Roche 公司,CollagenⅡ、胰蛋白酶、EDTA、MTT、DMSO 购自美国Sigama公司,人角质形成细胞培养基K-SFM、胎牛血清FBS购自美国Gibco公司,DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司,羟脯氨酸测试盒购自南京建成生物工程研究所,兔抗人角蛋白K19单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司,羊抗兔SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司.
气体压力装置的设计可控压应力密闭容器的工作原理是:将95%空气、5% CO2的混合气体经 0.22 μm 滤器过滤后充入可控压应力密闭容器,通过控制储气罐上的气体流量计及密闭容器上的进、出气口开关,使密闭容器内的气体压力稳定在实验需要设定的压力值,通过密闭容器上方的压力表显示容器内的气体压力.该装置易操作,安全性、可靠性高.实验时,将种植有细胞的器皿放入密闭容器中,然后将密闭容器放到 37℃的 CO2孵育箱里.无压力对照组放进同一个 CO2孵育箱.
二、细胞培养及 HKC 的鉴定
细胞提取和培养
取健康汉族成人包皮环切术后的皮肤组织(由太原东方医院提供,患者具有知情权),用含青、链霉素的 PBS 彻底清洗,无菌条件下去除皮下脂肪、血凝块等杂物,表皮面朝上,0.25% DispaseⅡ4℃过夜分离表皮和真皮,采用胰酶消化法提取 HKC,用 K-SFM 培养HKC.采用胶原酶消化法原代培养 HFB,用含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基培养HFB,每隔 1~3 d 换液一次.
待原代 HKC 生长融合至 60%时,换为无细胞因子 EGF 与 BPE 的 HKC 专用培养基K-SFM,培养 48 h 后收集上清液,保存于 4℃备用.使用时,以 DMEM 稀释配置为 50%浓度.待原代 HFB 生长融合至 80%后,用含 0.02% EDTA 的 0.25%胰蛋白酶按 1∶3 比例传代.本实验使用第三代生长状态良好且处于对数增殖期的细胞.
HKC鉴定
待原代 HKC 生长融合至 80%时,用含 0.02% EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化细胞,以每孔104个接种于96 孔板,采用人角蛋白 K19 对 HKC 进行鉴定.细胞经 4%甲醛溶液固定后,参照文献[8]按试剂盒说明书应用 SABC 法、DAB 显色及苏木精复染法,显微镜下观察HKC.
实验分组HFB以2×104个密度接种于 24 孔板 24 h 后,用 DMEM 与 HKC 上清液 (1∶1) 混合液培养,并以DMEM 与 K-SFM (1∶1) 混合液培养的 HFB 为对照组,培养 24 h 后,部分细胞用3.4 kPa 气体压力分别加载 5 h 或 10 h,另一部分细胞无压力培养 5 h 或 10 h 作为对照组,实验分为4 组.A 组:K-SFM 与 DMEM (1∶1) 混合液及无压力加载培养的 HFB;B组:HKC 上清与 DMEM ( 1 ∶1) 混合液及无压力加载培养的 HFB; C 组: K-SFM 与DMEM (1∶1)混合液及加载3.4 kPa气体压力培养的HFB;D组:HKC上清与DMEM(1∶1)混合液及加载3.4 kPa气体压力培养的HFB.
三、 MTT法测定成纤维细胞的增殖情况
在3.4 kPa气体压力加载5 h或10 h后,各组细胞每孔中加入MTT (5 g/L) 50 μl,每组重复5孔(n=5),37℃、5% CO2孵育箱培养4 h 后,加入 DMSO 150 μl,振荡 15 min 直至结晶物完全溶解.
在酶联免疫检测仪上测定各组HFB的吸光值( OD值),检测波长为490 nm,记录结果.OD值代表活细胞的相对数量,OD值增大,表明活细胞数量增多;反之,表明活细胞数量减少.
羟脯胺酸比色法测定上清液中胶原蛋白的分泌量
在 3.4 kPa 气体压力加载 5 h 或 10 h 后,收集各组上清液 0.5 ml 于试管中,每组重复 3孔(n=3),严格按照试剂盒操作说明书测定各组上清液中羟脯氨酸在 550 nm 处的吸光值(OD值),并根据公式计算羟脯氨酸含量,间接反映各组 HFB 胶原蛋白的含量.计算公式为:羟脯氨酸含量(μg/mL) = [(测定管吸光度 - 空白管吸光度) / (标准管吸光度 - 空白管吸光度)] ×标准管含量×水解液总体积(ml) /取样量(ml).
其中,HKC 上清液与 DMEM(1∶1)混合液培养 HFB 组,以 HKC 上清液与 DMEM (1∶1) 混合液为空白;K-SFM 与DMEM (1∶1)混合液培养 HFB 组,以 K-SFM 与 DMEM (1∶1) 混合液为空白.
四、统计学处理
实验结果以 x±s 表示,采用 SPSS 19.0 统计分析软件以单因素方差分析数据,检测各组之间是否存在差异,P<0.05为具有统计学差异,图表采用 Origin 8.0 软件制作.
五、 结 果
细胞培养及 HKC 的鉴定
培养的表皮细胞接种 24 h 后,可见部分细胞贴壁,细胞呈圆形、三角形或椭圆形,贴壁 3 d 可以形成小的集落,10 d 左右细胞融合成片,呈现典型的铺路石样排列 (如图 1).经兔抗人 K19 免疫细胞化学染色显示:细胞浆内 K19 染色阳性,呈棕黄色,衬染的核为蓝色(如图 2),说明所提取的人表皮细胞为 HKC.消化法培养的 HFB 刚接种时呈球形,24 h 左右大部分细胞开始贴壁生长,7 d左右融合.
倒置相差显微镜下观察,可见细胞呈长梭形生长,排列紧密,呈典型漩涡状走行(如图3).
各组中成纤维细胞的增殖情况
经单因素方差检验,FOD=31.542,dfOD=7,如图 4 所示,同一时间点不同组之间进行比较发现:HKC 上清液作用 5 h 后,B 组 OD 值显著高于 A 组 (P<0.05),其它组之间无统计学差异;HKC 上清液作用 10 h 后,B 组 OD 值显著高于 A 组 (P<0.05),D 组 OD 值显著高于 C 组 (P<0.05),其它组之间无统计学差异.
如图 5 所示,同一时间点不同组之间进行比较发现:3.4 kPa 气体压力作用 HFB 5 h后,C 组 OD 值较 A 组显著下降 (P<0.05),D 组 OD 值较 B 组显著下降 (P<0.05),其它组之间无统计学差异;3.4 kPa 气体压力作用 HFB 10 h 后,C 组 OD 值较 A 组显著下降 (P<0.05),D 组 OD 值较 B 组显著下降 (P<0.05),D 组 OD 值较 A 组显著上升 (P<0.05),其它组之间无统计学差异.同一组不同时间点比较发现:C 组 3.4 kPa 气体压力作用 10 h 较 5 h的OD值显著下降(P<0.05),其它组之间无统计学差异.
各组上清液中胶原蛋白的分泌量
经单因素方差检验,Fcollagen=16.874,dfcollagen=7,如图 6 所示,同一时间点不同组之间进行比较发现:HKC 上清液作用 5 h 后,B 组 HFB 胶原蛋白合成量显著高于 A 组 (P<0.05),其它组之间无统计学差异;HKC 上清液作用 10 h 后,B 组 HFB 胶原蛋白合成量显著高于A 组 (P<0.05),D 组胶原蛋白合成量显著高于 C 组 (P<0.05),其它组之间无统计学差异.
如图 7 所示,3.4 kPa 气体压力作用 HFB 5 h 后,各组之间无统计学差异;3.4 kPa 气体压力作用 HFB10 h 后,C 组 HFB 胶原蛋白合成量较 A 组显著下降 (P<0.05),D 组胶原蛋白合成量较 B 组显著下降 (P<0.05),D 组 HFB 胶原蛋白合成量较A 组显著下降 (P<0.05).其它组之间无统计学差异.
同一组不同时间点比较发现: C 组 3.4 kPa 气体压力作用10 h较5 h的HFB胶原蛋白合成量显著下降(P <0.05),其它组之间无统计学差异.
六、 讨 论
HFB是创伤修复过程中真皮的主要功能细胞,能合成细胞外基质的多种成分,而细胞外基质的过度沉积和降解不足可致创伤的过度愈合,形成病理性瘢痕(增生性瘢痕和瘢痕疙瘩).HFB的过度增生及分泌旺盛引起细胞外基质的过度沉积,直接导致增生性瘢痕的形成.只有尽量去除各种造成瘢痕增生的影响因素,增生性瘢痕才能及早得到治疗[9~11].
压应力在增生性瘢痕治疗中起到了重要作用,体外研究压应力对皮肤细胞和组织的影响,可以为在体环境下压力在瘢痕基质代谢中的作用提供参考.临床上多采用几种方法相结合的方式治疗增生性瘢痕,其中,采用手术疗法彻底切除增生性瘢痕,再移植组织工程表皮薄片结合压力法治疗增生性瘢痕是常用的治疗方法.临床实践证明,加压的压力一般为 3.4 kPa 左右,否则患者无法长期坚持,而临床上对增生性瘢痕压迫治疗需要及早、持续、长期维持.但临床上手术切除瘢痕后表皮移植及结合压力治疗增生性瘢痕的具体机制尚不明确.压力可能是通过降低瘢痕组织附近血液供应,从而减少瘢痕组织中细胞的增殖,降低细胞外基质沉积;也可能是直接或间接抑制了细胞增殖和细胞外基质合成的信号通路,或促进了细胞外基质分解的信号通路[12].肖洪等[13] 研究认为,适当的持续压应力对人增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制增殖与促进凋亡的共同效应. HKC 的条件培养液释放的因子在 HFB 细胞外基质基因表达中起调控作用[14~16],HKC分泌的多种细胞因子,如白介素(IL-1,IL-6,IL-8 等)、转化生长因子 (TGF-β1 等)、肿瘤坏死因子、干扰素等[17~19],均可调控 HFB 的增殖及胶原蛋白的合成.其中,IL-1α 可明显抑制 HFB 的胶原蛋白合成[20],TGF-β1 可以促进 HFB 的胶原蛋白合成[21] .
本课题组发现,无压力培养的HKC分泌的胶原蛋白量低于无压力培养的HFB分泌的胶原蛋白量,只有其1/10,且实验中采用与国内外其他工作组相同的条件和方法保存 HKC 上清液:均离心后保存于4℃备用.
其他工作组在研究HKC上清液对HFB分泌的胶原蛋白含量的影响时,均忽略了HKC 上清液中胶原蛋白的含量,可能原因是于 4℃保存 HKC 上清液时,HKC 分泌的微量胶原蛋白存在降解的情况,故实验中忽略了HKC分泌的胶原蛋白对HFB分泌的胶原蛋白含量的干扰作用.本实验结果显示:无力学刺激时,随着时间的推移,HFB 数量及胶原蛋白的分泌量逐渐增多;有力学刺激时,随着压力加载时间的推移,HFB 数量增加减缓,胶原蛋白的分泌速度减慢,说明3.4 kPa 气体压力抑制了 HFB 增殖及胶原蛋白的合成;加入HKC 上清液促进了 HFB 增殖及胶原蛋白合成,即:两种细胞的相互作用对伤口的愈合及再上皮化均有明显的促进作用.3.4 kPa气体压力加载5 h对HFB增殖及胶原蛋白合成的抑制作用,与HKC上清液对HFB增殖及胶原蛋白合成的促进作用达到平衡;而3.4 kPa气体压力加载10 h对HFB增殖的抑制作用小于HKC上清液对HFB增殖的促进作用,对HFB胶原蛋白合成的抑制作用大于HKC上清液对HFB胶原蛋白合成的促进作用.
可以推测,正常的HKC上清液促进细胞增殖的作用早于3.4 kPa气体压力抑制细胞增殖的作用,而3.4 kPa气体压力抑制胶原蛋白合成的作用早于正常的HKC上清液促进胶原蛋白合成的作用,这与压力抑制细胞增殖和胶原蛋白合成,以及上清液促进细胞增殖和胶原蛋白合成的信号通路不同有关.
厉孟等[22]推测 HKC 与 HFB 之间的调节可能是多种因子介导的,二者之间存在一个“HKC→各种HKC源活性因子(IL-1α、IL-1β等) →HFB→各种HFB源活性因子(IL-6、TGF等) →HKC”的环路,但其具体机制仍有待于研究.
为了使实验结果更加可信,我们正在采用其它检测手段,如 Western Blot、PCR 扩增等技术进行对比性实验,以进一步说明 HFB 基因及胶原蛋白分类表达的情况.大量研究显示压力可以抑制 HFB 增殖及胶原蛋白合成,但仍不清楚力学信号的感受和响应机制及压力抑制细胞增殖和胶原蛋白合成,与上清液促进细胞增殖及胶原蛋白合成的信号通路的不同之处,这些都将是我们下一步的研究重点.
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