与体循环不同，肺循环血流阻力低，血管压力低，血管壁薄，可扩展性好，肝源性肺损伤可引起肺循环相应的组织结构改变。肝肺综合症是在肝病和／或门静脉高压的基础上出现的肺血管扩张和肺小血管增生为特征，且与肝病相关的动脉血氧合作用异常而导致的一类综合征，在肝硬化病人中的发生率在５％～３２％。近年来，肝肺综合征发病过程中，肺动脉平滑肌细胞的异常增值和迁移是可能是形成肺微血管扩张和血管增生的一个重要机制。因此，肺动肺平滑肌细胞的分离、培养成为研究肺血管壁细胞生物学行为及血管增生性疾病发生发展中的重要手段。然而，目前成人肺动脉平滑肌细 胞 （ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ，ＰＡＳＭＣｓ）体外培养受制约的因素较多，很难获得成功。本实验旨在通过改良的组织块法建立稳定的成人肺动脉平滑肌细胞体外培养的模型，为开展肝源性肺损伤相关的实验奠定良好的基础。兹将改良成人肺动脉平滑肌细胞分离、培养和鉴定的方法报道如下。
１材料和方法
１．１材料
胎牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国）、青霉素和链霉素（ｓｉｇｍａ公司，美国）、高糖ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国）、ＰＤＧＦ－ＢＢ（武汉博士徳）和０．２５％胰蛋白酶（Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国），Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（北京索莱宝公司）；ＳＭ－α－ａｃｔｉｎ和ｃａｌｐｏｎｉｎ单克隆抗体（Ａｂｃａｍ公司，英国），ＦＩＴＣ标记山羊抗兔ＩｇＧ和ＤＡＰＩ、抗荧光淬灭封片液（上海碧云天公司），生物安全操作柜、ＣＯ２细胞 培养箱、振 荡器（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ公司，美国），低温离心机（ｅｐｐｅｎ－ｄｏｒｆ公司，德国），电控恒温水浴箱（天津市泰斯特有限公司产品），倒置相差显微镜及荧光显微镜ＢＸ５１（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）。
１．２平滑肌细胞的分离与培养
征得患者同意后无菌条件下取良性病变肺叶切除手术中废弃的肺叶用无菌生理盐水清洗去除血污。用眼科镊分离出细小肺动脉并撕去平滑肌外膜，眼科剪刀纵行剪开血管，内膜面朝上，轻轻刮去内膜组织。获得干净光滑的血管段，将剥离的血管中膜用眼科剪剪成约１ ｍｍ×１ ｍｍ大小的碎片。将组织块贴附于培养瓶底，每次可以接种２～４瓶，并每瓶加入４～５ ｍＬ含２０％胎牛血清、１０μｇ／ＬＰＤＧＦ、１００Ｕ／ｍＬ青霉素及１００ｍｇ／ｍＬ链霉素的含高糖ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １∶１的培养基。
１．３传代细胞的培养
当原代细胞长出并逐渐相互交融形成致密单层细胞时即可传代培养。首先吸去培养液，用无菌ＰＢＳ溶液洗涤３次。加入０．１％胰蛋白酶覆盖细胞表面消化，在倒置相差显微镜下观察，约１ｍｉｎ后，可见大部分细胞收缩变形，边缘分界清楚，此时翻转培养瓶，加入含有１０％胎牛血清的培养液以终止胰蛋白酶，停止消化。用滴管轻轻吹打分散细胞制成细胞悬 液，取悬液 于 离 心 管 内８００ｒ／ｍｉｎ离 心５ｍｉｎ，去上清液后再加入１０％培养基，轻轻吹打分散细胞制成细胞悬液后，按１∶２瓶的比例，接种到新的培养瓶中进行培养，每天观察细胞形态，据细胞生长情况，约３ｄ换液１次。
１．４平滑肌细胞形态观察
在倒置相差显微镜下观察平滑肌细胞生长状况。
１．５平滑肌细胞鉴定
取第３代细胞生长接近单层盖玻片，吸出培养液，依次加入４％多聚甲醛固定３０ｍｉｎ，０．１％Ｔｒｉ－ｔｏｎＸ－１００ ３０ｍｉｎ，３％Ｈ２Ｏ２１ｍＬ，３７℃ ３０ｍｉｎ，用一抗（α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ １∶１００、ｃａｌｐｏｎｉｎ １∶２００），３７℃孵箱过夜，再分别加入二抗（抗兔ＦＩＴＣ－ＩｇＧ １∶１００）３０ｍｉｎ和ＤＡＰＩ复染１５ｍｉｎ，每次加入试剂前后均用ＰＢＳ洗涤５ｍｉｎ×３次，滴加少量抗荧光淬灭试剂，封片，在荧光显微镜下观察结果。用血管平滑肌细胞特异的α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ、ｃａｌｐｏｎｉｎ抗体进行免疫组织化学方法的染色，应用荧光显微镜下观察每个视野中染色阳性的细胞占所有细胞的比例。
２结果
２．１肺动脉平滑肌细胞形态观察结果
（１）原代培养平滑肌细胞：倒置相差显微镜下观察，成人ＰＡＳＭＣｓ沿组织块爬出时间为７～９ｄ，细胞呈长梭形，有突起并相互接触。见图１。细胞培养至第１３～１５天，开始进入对数生长期，并且组织块之间的细胞呈现出典型的" 峰谷" 征象。见图２。
（２）传代培养平滑肌细胞：５例成人ＰＡＳＭＣｓ原代培养时间（２０±２）ｄ，细胞进入对数生长期时间均为传代后２４ｈ。成人ＰＡＳＭＣｓ原代培养全部获得成功。培养过程中未见内皮细胞、成纤维细胞或微生物污染。
２．２肺动脉平滑肌细胞应用免疫荧光组织化学染色进行鉴定。
结果免疫荧光组织化学染色后，抗α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ和ｃａｌｐｏｎｉｎ平滑肌肌动蛋白均可见胞质内肌丝被染成绿色，细胞核经ＤＡＰＩ染色后清晰可见，呈蓝色，椭圆形，细胞平均阳性率≥９８％。见图３、４。
３讨论
肝肺综合征主要以肺血管扩张和肺小血管增生为典型的病理改变，而肺血管平滑肌细胞是构成其血管壁的重要细胞成份，其体外培养是研究肝源性肺血管损伤及血管增生性疾病的重要手段。稳定细胞培养可使细胞在标准的，可控的条件下进行研究，但成人ＰＡＳＭＣ的体外培养很难成功。分离培养成人的肺动脉平滑肌细胞最能体现其病变的生物学特征。然而，目前国内外大多数实验室仍主要选用兔、猪、鼠等较易培养的动物肺血管体外培养平滑肌细胞来建立研究模型，尽管动物的ＰＡＳＭＣ较容易培养，但其与人（尤其是成人）的肺血管平滑肌细胞在形态学及生物学特性方面存在很多的差异，由此而得出的实验结果并不能准确模拟人体的肺血管的生物学特征。亦有少数采用人胎儿脐动脉，而很少采用培养成人细小肺动脉进行研究。成人的细小ＰＡＳＭＣ之所以培养难度很高，其主要原因是组织内绝大多数成人ＰＡＳＭＣ处于休眠期，进入分裂期的细胞相对较少，而且成人ＰＡＳＭＣ繁殖力较弱，传代不稳定，细胞经数次传代易发生细胞“老化”，造成其体外培养成功率很低。
目前，原代培养ＰＡＳＭＣ的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法，酶消化法培养周期虽短，但其操作复杂，酶作用时间不易掌握，且消化酶本身对细胞具有毒性作用，不易获得稳定的细胞株。组织块贴壁法虽然操作简单，经济实用，但同时具有原代细胞到达传代时间较长，成功率不高，而且容易出现“去分化”。通常认为，成人肺动脉平滑肌细胞是高度分化的细胞，不易培养成功，经过反复摸索，我们建立了一种改良培养成人肺动脉平滑肌组织块贴壁法。
血小板衍性生长因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＰＤＧＦ）是公认的最强的有丝分裂的激活因子。在此改良方法中，加入的ＰＤＧＦ通过与细胞膜上的ＰＤＧＦ受体结合并随之被激活，平滑肌细胞表型从正常的收缩型变成幼稚的合成型，促进平滑肌细胞的增殖和迁移。又因ＰＤＧＦ受体代谢非常快，ＰＤＧＦ与其受体结合后形成复合物，此复合物迅速进入细胞内，且随之降解。加上在无血清及ＰＤＧＦ的ＤＭＥＭ里同步化后，ＰＤＧＦ的作用即消失，所以对后期的试验干预不产生影响。体外培养平滑肌细胞在高葡萄糖浓度（≥９ ｍｍｏｌ／Ｌ）时，ＰＤＧＦ受体表达增高，从而使血管平滑肌细胞迁移能力增强。因此，ＰＤＧＦ和高糖克服了成人血管平滑肌体外培养休眠期过长的缺点，从而缩短了培养周期，提高了培养的成功率。组织块翻面的时间以１０～１４ｈ为宜，时间过长或者过短都会造成细胞死亡。一般７～９ｄ可观察到细胞从组织边缘呈放射状长出，但５ｄ内不易移动，以免贴壁的组织块脱落，而脱落的组织块很难有细胞长出。传代的过程中，以０．１％胰蛋白酶浓度为宜，在室温２０～２５℃条件下，最佳的酶消化时间为６０～８０ｓ，在该浓度及消化时间下刚好能使成人ＰＡＳＭＣ从瓶壁上消化下来，即可起到去除成纤维细胞及纯化平滑肌细胞的作用，又可不致细胞死亡。同时，培养细胞的鉴定多采用平滑肌细胞抗体α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ，但α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ特异性较差，除平滑肌细胞外，还可表达于成纤维细胞，肌上皮细胞，骨髓间质肝细胞等。钙调蛋白ｃａｌｐｏｎｉｎ为平滑肌细胞特异性抗原，故本实验选用α－ＳＭ－ａｃｔｉｎ，ｃａｌｐｏｎｉｎ两 种 抗 体 作 为 免 疫 荧 光 染色，结果９８％培养细胞呈阳性，说明说培养的细为平滑肌细胞，经过传代，细胞可以纯化。
总之，本实验通过在高糖培养基中加入ＰＤＧＦ的改良方法，克服了成人ＰＡＳＭＣ具有生长缓慢、休眠期长的生物学特性，成功地能在３～４周内获得能传代的原代成人ＰＡＳＭＣ。运用此方法获得稳定的成人原代ＰＡＳＭＣ，经过同步细胞纯化，能够较快建立起所需的实验模型。该体外培养方法不但克服了ＰＡＳＭＣ培养困难的问题，且为肝源性肺血管性疾病及肺血管增生性疾病的研究提供了一条简便、稳定新途径；更重要的是，较动物或胎儿的体外培养血管平滑肌细胞模型所得的实验结果，此改良建立的成人ＰＡＳＭＣ模型因更符合人体实际情况而更具有说服力。
参考文献
１ Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｌｕｏ Ｂ，Ｔａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎ ａ Ｒａｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｇａｓ－ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００９，１３６：１０７０－１０８０．
２ Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｆａｌｌｏｎ ＭＢ．Ｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｕｐ－ｄａｔｅ ｏｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅ－ｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１２，９：５３９－５４９．
３ Ｙｉ Ｂ，Ｚｅｎｇ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ１ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｇｕ－ｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＭＶＥＣ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎＣＢＤＬ ｒａｔ ｓｅｒｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅ－ｍｏｄｅｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３，１１：９８．
４ Ｚｅｎｇ Ｊ，Ｙｉ Ｂ，Ｗａｎｇ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２ｏｎｈｅｐａｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｒａｔ ｓｅｒｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒ－ａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｒｅ－ｓｐｉｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，２０１３，１８５：３３２－３３８．
５周晓莉，雷寒，柳青．血管平滑肌细胞的培养及鉴定［Ｊ］．重庆医学，２００５，３４：８７７－８７８．
６程孝中，宋婷，黄蓓，等．人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立［Ｊ］．军事医学科学院院刊，２０１０，３４（１）：１１．
７董霞，朱敦皖，宋丽萍，等．人脐动脉平滑肌细胞培养及转染ＴＦＰＩ基因的实验研究［Ｊ］．国际生物医学工程杂志，２０１０，３３（５）：２９３－２９６．
８ Ｍｅｔｚ ＲＰ，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ ＪＬ，Ｗｉｌｓｏｎ Ｅ．Ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１２，８４３：１６９－１７６．
９曾涛，陈衔城，孙安，等．人脑动静脉畸形血管平滑肌细胞的培养和鉴定［Ｊ］．中国临床神经科学，２００５，１３（１）：８３－８５．
１０ Ｋｉｍ ＴＪ，Ｈａｎ ＨＪ，Ｈｏｎｇ ＳＳ，ｅｔ ａｌ．ＣｕｄｒａｔｒｉｃｕｓｘａｎｔｈｏｎｅＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｂａｒｋ ｏｆ Ｃｕｄｒａｎｉａ ｔｒｉｃｕｓｐｉｄａｔａｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＤＧＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２００７，３０：８０５－８０９．
１１ Ｌｉ Ｌ，Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ＤＫ，Ｍａｓａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍａｔｉｎｉｂ ｏｎ ＰＤＧＦ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄＰＤＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｖｅｎｏｕｓｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ－ｔｒｙ，２００６，９９：１５５３－１５６３．
１２ Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ ＰＵ，Ｌｏｏｍａｎ Ｃ，Ａｈｇｒｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｂｅｔａ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ａｒｔｅｒｉｏ－ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，２７：２１４２－２１４９．
１３ Ｔｏｎｇ Ｘ，Ｙｉｎｇ Ｊ，Ｐｉｍｅｎｔｅｌ ＤＲ，ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉ－ｄｉｚｅｓ ＳＥＲＣＡ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－６７４ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｎｉ－ｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｏｆ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ ＭｏｌＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ，２００８，４４：３６１－３６９．
１４ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ Ｄ，Ｓｈａｎａｈａｎ Ｃ．Ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１２，８０６：２５１－２６３．
１５ Ｃｈｕｒｃｈｍａｎ ＡＴ，Ｓｉｏｗ ＲＣ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒ－ａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｍｅｔｈ－ｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００９，４６７：１２７－１３８．
１６ Ｂｙｇｇｌｉｎ Ｈ，Ｌａａｋｓａｍｏ Ｅ，Ｍｙｌｌ?ｒｎｉｅｍｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｉｓｏｌａ－ｔｉｏｎ，ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ ａｎｅｕｒｙｓｍｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｎｅｕ－ｒｏｃｈｉｒｕｒｇｉｃａ，２０１１，１５３：３１１－３１８．
