血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMC）对维持动脉壁结构和功能的完整性起到了重要作用。OPG作为肿瘤坏死因子受体超家族成员及细胞核因子-κB受体活化因子配体的诱导受体，不仅参与了骨的代谢过程，也参与了血管壁的钙化。目前已经有大量研究证实OPG与人类心血管疾病之间存在一定的关系。尽管OPG在骨代谢过程中的作用已经逐步被阐明，但其在VSMC中的调节作用仍不明确。本研究采用RNA干扰技术，构建OPG过表达及OPGRNA干扰的腺病毒产品，感染HVSMC，检测各组VSMC中OPG的表达情况以及VSMC凋亡情况，从而对OPG与VSMC凋亡之间的关系进行初步探讨。
1、 材料与方法
1.1 材料 HEK293细胞（美国菌毒种保管中心）。大肠杆菌DH5α及腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1，pYr-2.1-hU6OPG基因（pOTB7-OPG）（长沙赢润生物技术有限公司，中国)。羊抗人OPG多克隆抗体及碱性磷酸酶标记的驴抗羊IgG（SantaCluz公司，美国）。MULV逆转录试剂盒、限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶等（NewEnglandBiolabs公司，美国）。小量质粒提取试剂盒（上海生工公司，中国）。Hoechst33258染色试剂盒及AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基公司，中国）。冻存HVSMC细胞由湘雅二医院内分泌科谢辉博士惠赠。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增OPG基因 以pOTB7-OPG载体为模板，PCR扩增OPG基因。引物对：OPG-f：5'-CG GGA TCC GCCACCAT GAA CAA CTT GCT GTG CTG-3'BamHIOPG-r：5'-GG AAT TCG GCC ATT TCC AGT TAT AAG CA-3'EcoRI。预计扩增片段大小为1.2kb,1%琼脂糖凝胶电泳，回收OPG条带。
1.2.2针对OPG基因siRNA序列的确定和合成通过Ambion寻找OPG的siRNA靶点靶序列并设计对应的寡核苷酸序列，根据OPG的基因序列和二级结构，筛选出3对特异性siRNA，根据siRNA设计原则综合考虑，选择第三条靶序列:正义链5’-GCT CAG TTT GTG GCG AAT AAA-3’，反义链5’-TTT ATT CGC CAC AAA CTG AGC-3’，以上述靶序列为基础，设计OPG-shRNA引物。
1.2.3 重组表达质粒的构建及鉴定。分别将OPG的PCR产物及OPG-shRNA片段转载至腺病毒穿梭载体pYr-adshuttle-1和pYr-2.1-hU6上，挑取克隆，用BamHI、EcoRI做双酶切鉴定。选取酶切鉴定正确的克隆送去测序，以进一步确认此质粒为腺病毒骨架载体，并且已经成功插入OPG及OPG-shRNA目的基因。
1.2.4 VSMC培养及鉴定。冻存VSMC复苏后培养于含100ml/L胎牛血清的培养基中，置于37℃，50ml/LCO2细胞培养箱中培养。经平滑肌细胞特异性鼠抗人α-actin单克隆抗体免疫组化鉴定后，证实为VSMC，实验用4~8代细胞。
1.2.5 腺病毒感染VSMC细胞。将VSMC分为空白对照组、OPG过表达组、OPG过表达+OPGRNA干扰组。将VSMC以1×106接种于50ml的培养瓶中，24h后用腺病毒感染细胞。孵育48h后，消化、离心、收集细胞。
1.2.6 RT-PCR。按常规方法提取总RNA,逆转录成cDNA。OPG引物（366bp）:上游引物序列5’-CCGGAAACAGTGAATCAACT-3’；下游引物序列5’-CCA CTT TCT TTC CCG GTA-3’。GAPDH引物（452bp）：上游引物序列5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’；下游引物序列5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。PCR循环：94℃5min,94℃20s,52℃25s,72℃25s，共30个循环，72℃末次延伸3min。取PCR产物9μl,加1μl溴酚蓝,1.5%Agrose凝胶电泳30min(100V，35mA),紫外灯下观察DNA条带,拍照。
1.2.7 Western-blot。参照《分子克隆实验指南》的方法提取细胞总蛋白。考马斯亮蓝定量总蛋白后，于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。待电泳完毕后24V电转印16h至PVDF膜，在室温下封闭2h。加入鼠抗人OPG单克隆抗体，37℃孵育1h。
二抗为羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，二氨基联苯胺显色，数码照相。
1.2.8 Hoechst33258染色。 将HVSMC细胞接种于6孔板，接种密度为1×106个/孔，24h后用腺病毒感染细胞。孵育48h后，按Hoechst33258试剂盒说明书进行染色。
1.2.9 流式细胞术检测。 各组细胞培养48h后，经0.2％胰酶处理，离心收集细胞，用4℃预冷PBS洗涤2次，然后用250μl缓冲液重悬细胞，调整其浓度为1×106个/ml。取100μl细胞悬浮于5ml流式管中，加入5μlAnnexinV/FITC和10μl20ug/ml的碘化丙锭溶液，混匀后室温避光孵育15min，然后加缓冲液至500μl，流式细胞仪分析，获得细胞凋亡数据后用ModFitLT软件进行细胞凋亡相对定量分析。
2、结果
2.1 OPG及OPG-shRNA重组腺病毒的鉴定。经BamHI、EcoRI做双酶切，pAd-OPG重组质粒切出约600bp的目的条带（见图1），shRNA重组质粒切出约470bp的目的条带（见图2），符合预期，说明重组腺病毒rAd-OPG及rAd-OPG-shRNA包装成功。
2.2 RT-PCR结果。空白细胞组中，OPG表达量比较弱。OPG过表达组中，OPG表达量大大增加。
在OPG过表达+OPGRNA干扰组中，由于OPG表达受到抑制，OPG表达量下降较明显（见图3）。用分析软件Phoretix1D对各条带进行灰度分析，结果显示：与空白细胞组相比，OPG过表达组的OPG表达量增加；在OPG过表达+OPGRNA干扰组中，OPG-shRNA的干扰率达到73.9%，有效地抑制了OPG基因的表达（见表1）。
2.3 Western-blot结果。腺病毒感染VSMC后OPG蛋白表达结果显示,空白细胞组中OPG表达量比较弱。OPG过表达组中，OPG表达量大大增加。OPG过表达+OPGRNA干扰组中，由于OPG表达受到抑制，OPG表达量下降较明显（见图4）。用分析软件Phoretix1D对各条带进行灰度分析（见表2），结果显示：与空白细胞组相比，OPG过表达组的OPG表达量增加；在OPG过表达+OPGRNA干扰组中，OPG-shRNA的干扰率达到67.7%，有效地抑制了OPG蛋白的表达。
2.4 Hoechst33258染色。 Hoechst染色时，细胞核呈致密浓染，比正常核小；或呈碎块状致密浓染，亮度较正常细胞要高，出现典型的凋亡小体。OPG过表达+OPGRNA干扰组中有一部分细胞发生了凋亡，不过数量较少。而OPG过表达组中有大量细胞发生了凋亡（见图5）。
2.5 流式细胞术检测结果。 OPG过表达组的细胞凋亡率较空白细胞组有较大增加，而进行RNA干扰后，细胞凋亡率有一定程度下降（见图6）。结果显示，OPG的表达和VSMC凋亡之间存在正比关系。各组间生存细胞和凋亡细胞比率见表3，直方图见图7。
3、 讨论
VSMC作为腹主动脉中膜的主要细胞成分，对维持动脉壁结构和功能的完整性起到了重要作用。最近越来越多的学者注意到腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）组织中VSMC数量减少是AAA形成过程中不可忽视的因素。目前已经有大量研究证实OPG与人类心血管疾病之间存在一定的关系。尽管OPG在骨代谢过程中的作用已经被逐步阐明，但其在VSMC中的调节作用仍不明确。
有研究发现无论是人体AAA组织还是AAA动物模型，OPG水平升高的同时伴有VSMC数量的减少，提示OPG水平与VSMC的凋亡呈正相关，然而，究竟是因为OPG的升高加速VSMC的凋亡还是VSMC的凋亡发生后促使OPG表达增高仍不清楚。因此弄清楚OPG基因表达与VSMC凋亡之间的关系有重要的临床意义，有可能为AAA的基因治疗提供一种新的思路。
基因研究包括两个方面，基因过表达和基因表达的抑制。本研究通过OPG基因过表达及OPG基因的RNA干扰，即正反两方面来探讨其与VSMC凋亡之间的关系。RNA干扰技术作为一种十分有潜力的基因功能研究和基因治疗方法，目前已成为抗病毒、抗肿瘤、基因表达调控、基因功能研究、基因治疗等领域一个重要的研究方向和热点。空白对照组、OPG过表达组、OPG过表达+OPGRNA干扰组等各组细胞样本的RT-PCR及Western-blot结果显示：空白对照组中，OPG表达量较弱；OPG过表达组中，OPG表达量大大增加；OPG过表达+OPGRNA干扰组中，由于OPG表达受到抑制，OPG表达量下降较明显。以上结果充分说明重组腺病毒rAd-OPG-shRNA具有特异性抑制VSMC目的基因OPG的作用。对各组细胞样本进行Hoechst33258染色和流式细胞术分析，结果显示OPG过表达组可见大量高亮度的凋亡细胞出现，而OPG过表达+OPGRNA干扰组只有一部分细胞发生凋亡。与空白对照组相比，OPG过表达组的细胞凋亡明显，而OPG过表达+OPGRNA干扰组的细胞凋亡率与空白对照组细胞凋亡率相差不大。
流式细胞术分析结果显示：空白细胞组凋亡细胞占10.06%，OPG过表达组凋亡细胞占33.82%，而OPG过表达+OPGRNA干扰组凋亡细胞占19.71%，说明OPG过表达组的细胞凋亡率较空白细胞组有较大上升，而同时进行RNA干扰后，细胞凋亡率有一定程度下降。以上结果分别从细胞和蛋白水平验证了OPG基因表达与VSMC凋亡之间存在一定正比关系。OPG基因表达上调，则VSMC细胞凋亡率上升；而通过RNA干扰手段将OPG基因表达下调后，则VSMC细胞凋亡率具有一定程度的下降。
作为抑制基因表达的一种重要手段，RNA干扰近年来在基因治疗领域的应用越来越多。RNA干扰可能被用来治疗由于基因过度表达或异常基因表达引起的疾病。本研究表明，OPG基因的过表达可引起VSMC细胞凋亡。OPG表达与VSMC凋亡具有相关性，可能对动脉瘤形成有一定的作用。但是OPG的表达上调所导致的VSMC凋亡程度是否足以导致AAA的发生以及OPG的RNA干扰能否直接有效地抑制VSMC的凋亡仍需要进一步的动物实验验证以及后续研究。下一步可以考虑将RNA干扰应用于AAA的动物模型中，通过导入特异性抑制OPG基因表达的siRNA，降低OPG基因的表达量，防止VSMC凋亡，维持中膜结构的稳定性，观察其是否能对AAA起到减缓发展速度的作用。
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