近几十年来，随着人类对药品需求量的快速增长，制药行业的迅猛发展导致了大量混合制药废水的排放。制药废水中含有高浓度的悬浮物、盐、难熔化合物、毒性物质、有机和无机物等，且化学需氧量高，化学法与物理法都难处深度处理制药废水，所以高效微生物处理技术已成为研究热点。利用传统的微生物培养技术从环境中能分离培养的微生物只占总数的0．01%～10．00%，其他为未培养或活的但非可培养(viablebutnonculturable，VBNC)状态细菌，表明环境中绝大部分微生物尚处于未知状态。
自从1982年Xu等首次在环境中发现生存但不可培养的霍乱弧菌和大肠杆菌后，至今国内外已有大量文献报道了VBNC菌的相关内容。细菌由于多种因素导致进入VBNC状态，且仍具有生物活性但用常规培养法无法检出，在一定条件下可以复苏并保持原有功能。1998年Mukamolova等报道了藤黄微球菌(Micrococcusluteus)分泌的一种蛋白质能使该菌以及近缘的分枝杆菌(Mycobacterium)属的一些处于VBNC状态的细胞复苏成为可培养化，这种蛋白质被命名为复苏促进因子Ｒpf(resuscitationpromotingfactor)。已有研究表明，Ｒpf能复苏刺激大量革兰氏阳性菌的生长，包括My-cobacterium、Ｒhodococcus、Arthrobacter、Leifsonia、Bacillus、Nocar-dia、Kitasatospora、Streptomyces和Paenibacillus属的细菌。
丁林贤等研究表明，Ｒpf对难培养微好氧贫营养革兰氏阴性菌Curvibacterfontanus具有良好的促进生长的功能。目前，对于Ｒpf及VBNC菌的研究主要集中在医学、流行病学、病原菌分子遗传学等，其他领域尚少见有报道。2013年苏等综述了丁等人在近10年对于VBNC细菌以及在环境治理与修复中所起潜在功能的研究，揭示了Ｒpf对挖掘环境微生物资源的特殊利用价值。笔者从微生物学角度深入研究污水处理系统中VBNC菌体的形成机理，以期为挖掘Ｒpf及其VBNC微生物资源的可利用性等提供重要的研究思路与理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 研究对象
制药废水，采集于浙江省某制药公司经前处理的废水，经生物反应器(串联多塔式)连续流运行30、61、183和361d，分别从生物反应器最初出水段三点取样共取3g(折算为干重)至灭菌的100ml锥形瓶中，加入27ml灭菌蒸馏水搅拌20min均匀制成悬液待用。
1．1．2 试验菌种
藤黄微球菌MicrococcusluteusIAM14879(=NCIMB13267)，由东京大学分子细胞生物学研究所国际菌种保藏中心提供。依据研究介绍的方法制备M．luteus的DNA，确定rpf基因并在大肠杆菌中表达。rpf基因阳性菌的培养液离心经0．22μm膜过滤，作为含Ｒpf的试验处理组添加材料。
1．1．3 主要仪器
PCＲ反应扩增仪(TP600)，购自日本Takara公司;凝胶成像系统(GelDoc-It)，购自美国UVP公司;酶标仪(1510)，购自美国Thermo公司。
1．1．4 主要试剂
UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，SanPrep柱式PCＲ产物纯化试剂盒，16SrＲNA基因PCＲ扩增所用酶、引物和试剂，均购于上海生工生物工程有限公司。
1．2 方法
1．2．1 培养基的制备
MPN培养系液体培养基为反硝化细菌培养基，其组成为(g/L):KNO32．0g，MgSO4·7H2O0．2g，K2HPO40．5g，酒石酸钾钠20．0g，pH7．2，121℃，15min高压灭菌。MPN培养系分离纯化用PYM培养基组成(g/L):蛋白胨5．0g，MgSO4·7H2O1．0g，酵母膏3．0g，琼脂20．0g，pH7．0～7．2，121℃，15min高压灭菌。
1．2．2 MPN法和MPN培养系
利用MPN法和MPN培养系计数样品可培养细菌总数。以2．5～5．0ml透明玻璃瓶作为培养容器，添加浓度10%含Ｒpf制备液至液体培养基中作为处理组，以添加等量不含Ｒpf制备液作为对照组，将以浓度10%的样品悬液，以10倍浓度梯度稀释到10－6，每组重复3次，30℃静置培养。根据培养时间测定处理组与对照组吸光值的变化(OD660)，并以OD660值以及肉眼判断，记录处理组与对照组培养液的浑浊情况，浑浊为阳性，不浑浊为阴性。利用MPN表查出MPN值对应的处理组与对照组中的细菌总数。
1．2．3 Ｒpf阈值与VBNC状态菌的判断
以处理组与对照组MPN值分别对应的细菌总数之比作为Ｒpf阈值VＲ。当VＲ＞5时(95%置信度)，处理组的最前方某稀释段培养液浑浊(阳性)，而对照组与之相同稀释段为不浑浊(阴性)时，处理组浑浊培养液经稀释平板分离，纯化所得的菌为单位样品中总数处于优势的VBNC状态菌。当5＞VＲ≥1时，处理组与对照组最前端浑浊的培养液分别进行稀释平板分离，判断对照组与处理组菌落形态特征的差异，认为处理组中特有的特征性菌落为Ｒpf敏感的VBNC菌。
1．2．4 菌株分离纯化与保存
经3～10d静置培养并视MPN值趋于稳定时，将处理组与对照组中最先端呈浑浊的培养液稀释，利用平板分离法筛选、纯化获得相应的可培养化细菌。将纯化的细菌扩大培养用于细菌鉴定，以及添加10%的甘油做成冷冻甘油管在－80℃保存。
1．2．5 分离菌株16SrＲNA基因序列与系统发育树的构建
可培养化VBNC菌株的DNA提取按照生工UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行;PCＲ扩增采用细菌16SrＲNA基因通用引物7f(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540r(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')。PCＲ反应条件为:94℃5min;94℃30s，55℃35s，72℃1min，35个循环;72℃8min，4℃保存。PCＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，根据结果切割所需DNA目的条带，用SanPrep柱式PCＲ产物纯化试剂盒回收，PCＲ纯化产物送上海生工生物工程有限公司测序。测序所得菌株16SrＲNA基因序列结果在DDBJ登录取得菌株登录号码，在国际基因库NCBI和EzTax-onserver中进行序列同源性检索，挑选同源性高的典型菌株的16SrＲNA基因序列为参比菌种，利用MEGA5，按照Neighbor-Joining法聚类，构建系统发育树。
2 结果与分析
2．1 MPN培养系中MPN值与样品细菌总数
从制药废水连续流生物反应器中取样4次，MPN培养系中处理组与对照组的MPN值与每克样品中的细菌总数见表1，通过VBNC的复活率证实制药废水中存在利用一般培养基不能检出，但添加Ｒpf后对其敏感能复苏生长成为可培养化的VBNC状态细菌。
2．2 Ｒpf阈值及其培养液OD660值的变化
反应器运行30、61、183和361d所取样构建的MPN培养体系的Ｒpf阈值VＲ分别为16．0，55．8，2．2和1．9，表明制药废水生物反应器中，取样点单位样品中存在对Ｒpf敏感的VBNC优势菌群。图1表明，培养系中各稀释段培养液的OD660值，处理组均大于对照组，表明Ｒpf对培养系中的细菌有生长刺激作用。
2．3 分离菌株的16SrＲNA基因
序列同源性与系统树构建分离纯化菌种经测序后，利用国际基因库NCBI和EzT-axonserver进行序列同源性检索，各分离菌株的检索结果见表2。处理组中分离到的菌株类型更为丰富，其中Candidi-monas、Microbacterium、Gordonia、Aminobacter、Xanthobacter和Leucobacter属的近缘菌ZYM1、ZYM3、ZYZＲ2、ZYZＲ4、ZYYＲ1、ZYYＲ2、ZYYＲ3和ZYXＲ1在对照组同等数量级培养液中未发现，因而这些细菌可视为经Ｒpf复苏生长促进作用成为可培养化的VBNC细菌。
4个阶段所分离的17株细菌属于Proteobacteria门和Ac-tinobacteria门的两大系统发育类群，包含了高GC的革兰氏阳性菌的放线菌和革兰氏阴性菌，共7个科10个属，挑选同源性高的典型菌株的16SrＲNA基因序列为参比菌种，构建的系统发育树见图2。
2．4 新种水平菌株的16SrＲNA基因系统关系解析
细菌多相分类学鉴定程序中，16SrＲNA基因序列相似性在97%(或98%)以下一般认为有可能是新种。17株分离菌株中发现菌株ZYM1、ZYM3、ZYZＲ4、ZYYＲ1、ZYYNＲ1和ZYXＲ1与已知近缘菌的同源性较低，可能有存在较大的遗传差异。
特别是ZYM1、ZYM3、ZYZＲ4和ZYXＲ1这4株细菌构建系统树分析后发现极可能代表新的分类单元。菌株ZYM1的最近近缘标准菌是CandidimonasnitroreducensSC-089T(FN556191)，序列相似性为97．8%，菌株ZYM3的最近标准菌也是CandidimonasnitroreducensSC-089T(FN556191)，序列相似性为97．4%，但从系统树(图2)中发现菌株ZYM1，ZYM3与PusillimonasterraeAS85T(AB727962)离得最近，且这3株菌单独构成了一个进化分支，表明菌株ZYM1和ZYM3是新种的概率很高。菌株ZYZＲ4的最近标准菌是GordoniaotitidisIFM10032T(AB122026)，序列相似性为96．6%，且在系统树单独形成进化分支，差异性显著达新种水平。菌株ZYXＲ1的最近标准菌是LeucobacteraridicollisCIP108388T(AJ781047)，序列相似性为97．3%，但从系统发育树中发现菌株ZYXＲ1单独形成进化分支，有可能是Leuco-bacter属下的一个新种。对于分离到的这4株可培养化VBNC菌株我们将从多相分类学角度综合它们的形态特征、生理生化、化学分类和相关参比菌株的DND-DNA同源性以及其他关联基因等进化关系分析进行进一步的探讨。
3 结论与讨论
研究报道了在土壤与城市污水处理系统中发现基于Ｒpf复苏可培养化近缘的放线菌，具有较强的硝化反硝化、生物除臭功能以及利用Ｒpf分离到的VBNC菌具有较强的生物絮凝作用。苏等报导了从研究电器和电子废物的多氯联苯PCBs降解过程中发现活化的VBNC优势菌能使PCBs达到近乎100%的降解效果，揭示了Ｒpf与VBNC资源菌种的实际应用价值［9］。试验对可培养化VBNC优势菌种ZYM1、ZYM3、ZYZＲ2、ZYZＲ4、ZYYＲ1、ZYYＲ2、ZYYＲ3和ZYXＲ1的已知近缘菌种的功能进行了资料检索分析，推测其可能具有的潜在环境功能。除了菌株ZYM1和ZYM3的近缘菌在国内外尚未见有相关环境功能的报道外，菌株ZYZＲ2、ZYZＲ4、ZYYＲ1、ZYYＲ2、ZYYＲ3和ZYXＲ1的近缘菌种对于制药废水中存在的木质素、酚类化合物、纤维素、卤代甲烷、菲、芘、萘、二苯并噻吩、甲基氯、乙烯等都有较强的降解功能，并且对于一些难降解农药甲胺磷及其他一些环境污染物都表现出了可观的降解作用，对此试验将在以后的VBNC菌种的形成机理、潜在机能等探索试验中予以深入研究。基于生物反应器利用Ｒpf从制药废水中分离出VBNC菌株为深入研究与重新认识环境生态中微生物复合群集组成，形成机理，复苏活性化机制，直接获得微生物菌种资源以及类似难降解制药废水深度降解工程工艺的改进等研究提供重要的思路与方法。
