3.3 RNAi的遗传性和传播性
目前已有大量的资料证实，在低等生物中 RNAi可以传代，例如，在秀丽线虫（C. elegans）中通过生殖细胞可以传递好几代。另外，RNAi 效应可以在细胞和组织间扩散，dsRNA 可在生物体的不同组织间传递和维持[26,31].
3.4 RNAi的不完全性
RNAi 对基因表达水平的抑制是不完全的，只是引起了部分下调，利用基因表达水平减弱这种不完全的沉默效应，可以对关键基因或致死基因的功能进行详细分析[32,33].同时，可根据基因沉默效率的不同程度来研究不同基因表达水平所引起的表型变化等更为详细的信息。且对于不同的基因其最低抑制率是不同的，例如根据抑制效率的多少，结合具体表型的变化来分析研究药物靶标[1,34].
3.5 RNAi的可调控性
RNAi 是可以在不同组织和不同阶段进行实时调控的。已有研究报道称以可诱导型启动子或组织特异型启动子为骨架构建 RNAi 载体，可以实现时间特异性和组织特异性的基因沉默，从而调控 RNAi作用的产生[35].例如，Carneiro 等[36]利用可诱导乙醇脱氢酶alcA 启动子调控报告基因多聚半乳糖醛酸内切酶基因epg1 的 RNA 沉默，由于选择的碳源的差异，EPG 的表达能被不同程度的上调或下调。
3.6 RNAi的序列专一性
RNAi 具有序列专一性的特点，而不具有基因座专一性特点[31,37],该序列专一性可应用于基因家族的沉默表达。当靶基因所在的基因家族中存在一个或几个保守区域时，针对该保守区域设计的 RNAi载体便可诱导整个基因家族的沉默。尤其是当存在基因冗余现象而掩盖了基因缺失突变体的表型时，采用 RNAi 技术可以避免基因互补[32].
4 RNAi在真菌基因功能研究中的应用
在生物体生长发育过程中，抑制或沉默特定基因的表达技术通常用来研究该基因在该生理过程中的作用。目前，基因敲除和反义 RNA 技术已成为基因功能研究中最常用且很成熟的基因阻断技术。然而基因敲除技术，如通过同源重组进行敲除，操作复杂，一次只能完成一个基因的敲除，若靶基因是生长必需基因，则对该基因的敲除会导致个体的早期死亡而无法进行相关研究。同时，反义 RNA 技术抑制基因表达的效率较低，不利于目标基因的研究。
与基因敲除和反义 RNA 技术相比，RNAi 作为一种高效、特异的基因阻断技术，具有特异性、高效性、作用迅速性、高稳定性、操作相对简便、一次可研究多个基因等多方面的优势。目前 RNAi 正广泛地应用于功能基因组研究[38,39],并显示出非常广阔的应用前景。
随着分子生物学技术的不断发展，镰刀菌（F.oxysporum）、稻瘟病菌及大丽轮枝菌等 40 多种真菌的基因组测序工作已完成，GenBank 中积累了大量功能未知的真菌 DNA 序列[31,34].鉴定与明确这些基因的功能及生物学特性已成为当前研究中的热点问题和前进方向[40].而功能基因的分析迫切需要一种高效、高通量技术来鉴定基因功能。RNAi 技术可特异性地使特定基因沉默，其表现性状类似于基因功能缺失产生的表型[41],从而产生定向突变[42].因此，RNAi 技术以其快速、有效、能批量分析等优势，成为研究真菌基因功能的有效工具，在研究真菌的致病性及其营养生长方面尤为普遍[43],如对炭疽杆菌（Colletotrichum graminicola）[44]、 柄锈菌（Pucciniatriticina）[45]、 绿僵菌（Metarhizium anisopliae）[46]和扩展青霉（Penicillium expansum）[47]等致病性的研究，以及对深绿木霉（Trichoderma atroviride）[48]菌丝生长的研究。
4.1 RNAi发夹结构表达载体在真菌基因功能研究中的应用
目前广泛应用于真菌基因功能研究的一种 RNAi的方法是根据目的基因的反向重复序列结构构建可以诱发 RNAi 的发夹结构载体，即 hpRNA（HairpinRNA）表达载体。该表达载体导入真菌细胞后，在通用启动子 Ptrpc 作用下，反向重复序列会形成发夹结构的两臂，两臂之间由间隔序列相连，转录形成发夹结构的 dsRNA,dsRNA 被 Dicer 酶识别与加工后诱发目的基因沉默[15].hpRNA 表达载体于 2002年首次应用于新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的 RNAi 研究中，以 GFP 作为间隔构建 RNAi 发夹结构表达载体，结果显示表现完全突变表型的转化子占总转化子的 7%-10%[49].
为了更为高效地利用 hpRNA 表达载体研究真菌基因功能，发展了两臂之间由真菌的内含子相连以载体 pSilent-1（图 2）为基础的发夹结构表达载体，即 ihpRNA 表达载体。pSilent-1 载体自身含有潮霉素抗性基因（Hygromycin resistant cassette）、多克隆位点和内含子间隔区，从而大大简化了载体构建程序，成为发夹结构表达载体构建的有效骨架。
Nakayashiki 等[34]用 ihpRNA 表达载体研究丝状真菌稻瘟病菌MPG1基因的功能，较普通的基因沉默技术，该沉默效率明显提高，高达 70%-90%,完全突变表型占 10%-50%.2007 年，Krajaejun 等[50]发展了以 pFANTAi4 载体为骨架的 ihpRNA 表达载体，载体构建利用 Gateway 技术，简便、快捷、成功率高、对原始载体和目的片段的限制少，避免了困难和繁琐的"酶切 - 连接"步骤，简化了克隆步骤，而且沉默效率同样很高。目前，ihpRNA表达载体在真菌基因功能研究中已经得到了广泛应用，并且技术已经成熟。如在荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）[51]、白腐真菌黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）[32]、亚麻锈菌（Melampsora lini）[52]、 产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）[53]和长孢黄萎病菌（Verticilliumlongisporum）[54]等许多真菌中都进行了基因功能的研究。
4.2 反向双启动子系统RNAi载体在真菌基因功能研究中的应用针对大量单个基因或家族基因的基因功能的研究，若要构建 hpRNA 表达载体，需要确定目的基因的方向，工作量大又耗时，而反向双启动子系统RNAi 载体的构建只需将目的基因非定性插入两个启动子之间，载体导入细胞后，靶基因就会在两个反向双启动子的作用下分别进行转录形成正义 RNA 链和反义 RNA 链，然后形成 dsRNA,从而引起靶基因的沉默。这种载体非常适用于家族基因的沉默。
Nguyen 等[55]利用含有 TrpC 启动子（The trypt-ophan synthetase）和 gpdA 启动子（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）两个方向相反的双启动子结构的 pSD1（pSilent-Daul1）载体（图 3）研究了稻瘟病菌（M. oryzae）中所有涉及钙离子信号通路的 37 个相关基因，他们将编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的基因与靶基因融合后插入两个启动子之间，使其形成转录嵌合体，并通过荧光信号的减弱程度来检测双干涉对突变菌株的沉默效率。另外，Nguyen 等[56]采用"building blocks method"将人工合成的由 GH10 和 GH11 两个家族 10 个 40 bp大小的内切木聚糖酶目的基因形成的 400 bp 序列插入到反向双启动子系统 PSD1G（pSD1-eGFP）载体的EcoR V 位点构成 PSD1G-SDXYL 沉默载体，从而使同源内切木聚糖酶家族基因同时发生沉默，研究结果表明内切木聚糖酶有利于稻瘟病菌在感病叶片中纵向穿透和水平侵染，而且在致病过程中是作为一个群体来发挥作用的。同时也证明了对于多基因同时沉默这种载体比 hpRNA 表达载体更有效。对单基因沉默，有研究报道其效率相对低些，可能是由于 dsRNA 形成率较低[15].但是，Mu 等[57]在对灵芝（Ganoderma lucidum）的URA3基因进行研究时，证明了反向双启动子系统沉默载体的沉默效率要比发夹结构沉默率高，可达 81.9%.另外，他们通过对URA3和 laccase 以及一个报告基因的共沉默，说明了反向双启动子系统沉默筛选率可能更高。因此，反向双启动子系统 RNAi 载体更适用于高通量的真菌基因功能的研究。
4.3 siRNA或dsRNA直接导入真菌细胞应用于真菌基因功能的研究人工合成 siRNA 介导的 RNAi 在哺乳动物中的应用非常普遍，但是其在真菌中的应用报道却很少见。Khatri 等[58]在研究构巢曲霉的鸟氨酸脱羧酶ODC 基因时利用 23 nt 的 siRNA duplex 处理萌发的孢子引起孢子萌发和芽管生长明显减少，且培养 18h 后沉默水平最高，并持续到培养 48 h.而在哺乳动物中，人工合成siRNA介导的RNAi在数小时或1-2d 内明显激活并且可持续好多天[1].但不可否认该研究为真菌细胞 RNAi 提供了一种简单、快捷的方法。Moazeni 等[37]采用修改后的 PEG/LiAc 方法将不同浓度的 19 nt siRNA 导入白色念珠菌（Candidaalbicans）细胞，来抑制EFG1基因的表达，结果显示随着 siRNA 浓度的降低抑制作用也减弱，1 μmol/L的 siRNA 能够有效抑制EFG1基因的表达，其菌丝形成量明显减少，且降低了芽管的生长率，而采用100 nmol/L siRNA 时得到了满意的结果。
Whisson 等[59]通过脂质体介导原生质体转染的方法将 150-300 bp 大小的 dsRNA 直接导入致病疫霉菌（Phytophthora infestans）细胞，一种类似真菌的卵圆菌，促使inf1、edc14基因发生沉默，结果在转染 12-15 d 后，由于原来的 dsRNA 不再完整但在基因沉默过程中会发生级联放大效应，从而使 mRNA表达水平明显降低。
上述 3 种研究真菌基因功能的方法，前两种方法最常用，而将人工合成的 siRNA 或 dsRNA 直接导入真菌细胞的 RNAi 方法虽然方便、快捷，但在多数真菌中不能起到有效的沉默作用[15].
5展望
RNA 技术自 1998 年揭示以来，在植物、真菌、线虫等生物领域中取得了巨大成功，现已成为生命科学的研究热点之一。在显示出极大潜力的同时，在研究中也发现一些问题 :（1）RNAi 机制研究中 :RISC 组成成分如何，RISC 与 siRNA 具体如何结合，靶向 mRNA 裂解过程中，除 ATPase、解旋酶外，有没有其他大分子的参与，它们之间是如何相互作用的，与 RNAi 相关的基因有哪些、相关基因如何调控这一过程等问题尚需阐明。（2）siRNA 表达载体的设计 :由于一些 mRNA 序列在翻译之前可能掩藏在高度折叠的区域，或者与蛋白结合成牢固的复合体，从而干扰 siRNA 的特异性识别，导致 siRNA 并不能成功接近靶 mRNA,完成降解过程。（3）如何保证导入的 siRNA 的稳定性，避免细胞内 RNase 的降解，仍是一个需解决的问题。（4）RNAi 只需要靶基因的一小段序列，对于序列信息了解较少的真菌来说是一个优势，但可能会引起部分同源的非靶基因的沉默[1,56].沉默突变体无法通过重新导入靶基因形成恢复突变体。（5）RNAi 载体在基因组中的随机插入可能会引起一些关键基因的插入突变从而影响表型，Nakayashiki 等[34]在沉默稻瘟病菌PKS-like 基因时，引起黑色素合成基因 PKS 的插入突变，导致菌落颜色发生改变。因此需要筛选大量的沉默突变子才能准确分析断定靶基因的功能。（6）RNAi技术常在细胞水平进行研究，其对整个生物体的作用效果尚不明确，并且作用于 mRNA 的不同靶位时，RNAi 的效应机制存在差异。因此，应用 RNAi 技术需考虑其可行性，安全性和稳定性等问题。
尽管对 RNAi 的作用机制及应用还不是很清楚，但必须承认 RNAi 作为一种高效、特异性强的基因阻断技术，在功能基因组学上具有无穷的魅力，现已证明 RNAi 技术是一种无价的研究工具，在后基因组时代，可以更为快捷、有效地进行基因组功能研究，分析基因的功能。而且，这种技术将支持功能基因组学去发现和鉴定更多参与疾病和病害过程的新基因，为人类在基因研究领域开辟新路径。植物病原菌真菌是引起农作物病害的最大群体，是全球粮食安全的一个常见又主要的威胁，给全世界的农作物产量和市场化带来了严重损失[60]，研究其致病基因，RNAi 技术具有其他技术无可比拟的优势。
对于 GenBank 中积累的大量未知的真菌基因，RNAi技术可作为鉴定其功能的一种重要方法。另外，许多真菌如粗糙脉胞菌、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、 粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）和构巢曲霉等可作为模式生物应用于多种领域[4].相信通过对真菌 RNAi 机制进行不断地深入研究，RNAi 技术必将会更加完善和成熟，从而更好地探讨真菌与宿主间的相互作用，为疾病和病害防治提供新的策略[60],同时也会加快分子微生物学领域甚或整个生物学领域的研究步伐，显示出其广阔的应用前景。
