RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术作为分子生物学研究中发展迅速的一种新兴基因阻断技术，目前已成为生物领域的研究热点。它是一种进化上保守的作用机制，广泛存在于动物、植物和微生物中，包括真菌中的基因压制（Gene quelling）现象、植物中的共抑制（Co-suppression）现象和动物中的基因干扰现象[1].这些现象的产生主要是通过反义 RNA 与正义 RNA 形成的 dsRNA（Double-stra-nded RNA,dsRNA）分子，在细胞内被切割成 21-23 bp 大小的 siRNA（Small interference RNA），特异性降解与之同源的单个内源靶基因的 mRNA,从而阻断基因表达，产生基因沉默[2,3].近几年发展的RNAi 技术能够高效特异的沉默功能基因，使生物体产生相应的功能缺陷表型，以此确定基因的功能。
随着多种真菌如构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、大丽轮枝菌（Vertic-illium dahliae）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等基因组测序计划的完成，真菌基因功能的鉴定迫在眉睫[4].RNAi 技术以其特异、高效、广泛性优势，被迅速应用到真菌基因功能的研究领域中，逐渐成为一种具有潜力的基因功能研究技术。
1 RNAi的发现
20 世纪 90 年代初，Jorgensen 研究组将一个强启动子控制的色素合成相关基因--查耳酮合成酶基因（chs）转入牵牛花中，试图用转基因技术手段使紫色矮牵牛花的花朵更加艳丽，结果并未获得预期的深紫色花朵，反而得到了斑驳状花朵及白色的花。深入的研究证明，被转入该植物中的chs基因与牵牛花中与该基因同源的色素基因的表达均受到了抑制，这种外源基因和自身同源基因均受到抑制的现象被命名为共抑制（co-suppression）现象[5,6].
该现象同样出现于真菌转基因研究中。1994年，当 Cogoni 等[7]把外源同源基因转入脉孢菌（Neurospora）时，该基因及Neurospora自身的同源基因的表达均显着性的下降，当时把这种在真菌中发现的类似于共抑制的现象称为"基因压制"（Genequelling）现象，但当时并未明确其机制。
1995 年，美国康乃尔大学的 Guo 和 Kemphues博士等[8]发现由正义 RNA 和反义 RNA 形成的dsRNA 均能有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegans）中par-l基因的表达。这一发现有力地冲击了只有反义 RNA 形成的 dsRNA 才能有效地干扰具有同源序列的内源基因的表达这一传统观念。然而由于当时理论水平和实验依据的限制，这一现象并没有得到合理的解释。
1996 年，Cogoni 等[9]经过深入的研究证实真菌中的 gene quelling 与植物中的基因沉默机理基本相同。
1998 年，华盛顿卡耐基研究院的科学家 Fire[10]和麻省大学医学院的科学家 Mello 首次证实了 Guo等发现的由正义 RNA 抑制同源基因表达的现象是由于在体外转录制备的 RNA 中污染了 dsRNA 而引发，并将这种现象命名为 RNA 干扰（RNAi）。由于RNAi 的作用，功能基因无法表达而使其相对应的表型不能显现，导致基因功能的缺失或减弱，因此又将此作用机制称之为基因沉默（Gene silencing）。
Fire 和 Mello 的研究首次证明 RNAi 作用存在于生物界中，并因此获得 2006 年诺贝尔生理学和医学奖[11].
目前研究发现，很早以前 RNAi 就普遍存在于小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥和真菌等生物之中。在整个生物界进化过程中，它既是一种古老的生物学现象，又是一种保守的自我保护机制，因此又被称为"基因组的免疫系统".这种免疫机制的存在不仅能避免生物体的基因组受到诸如病毒基因的外源基因分子的干扰和袭击，而且，也能通过实时定量地调控各阶段基因的表达来控制和调节细胞分化[12,13].
2 RNAi的分子机制
RNAi 一经发现便引起了研究者们的高度重视，如今已成为一种高效的"基因沉默"技术，并在此技术基础之上衍生出了 TALAN 技术和 CRISPR 技术。该技术广泛应用于生物的基因功能鉴定和功能基因表达调控领域的研究，并且对 dsRNA 介导的基因沉默的分子机制的研究一直是生物学研究的热点。
经研究证明，RNAi 的分子作用机制在包括动植物的高等真核生物细胞中与真菌细胞中不尽相同。在动植物细胞中，依据 dsRNA 分子的来源，存在两种不同但又相关的 RNAi 途径 :siRNA 途径和 miRNA（microRNA）途径。siRNA 是由外源 RNA 或外源载体等导入细胞后产生的一系列小 RNA,它能与靶mRNA 完全互补并使其降解[14,15];miRNA 是一类由含颈环结构的前体 RNA 经过 Dicer 酶酶切而形成的非编码小 RNA,它与靶 mRNA 的 3'- 非编码区结合，抑制靶 mRNA 降解和翻译表达，从而导致特定基因的沉默，而且大多数 miRNA 参与了生长与发育，生理代谢或压力应激过程[4,16,17].在真菌细胞中，gene quelling 属于进化上保守的 siRNA 途径，即典型的 RNAi 途径，而 miRNA 途径尚未被发现[1,18].
另外，在粗糙脉胞菌中发现了第二种真菌基因沉默现象即减数分裂沉默（Meiotic silencing by unpairedDNA,MSUD），在第一次减数分裂前期，一段 DNA在亲本一方正常，另一方不存在，或在亲本双方不同从而产生了未配对的 DNA,使同源染色体不能正常配对，导致减数分裂异常，未配对的 DNA 就发生了沉默。这种现象发生在染色体配对到子囊孢子形成时期，MSUD 参与了生长发育周期，因此，可能与 miRNA 起源于同一种古老的沉默机制[4,15].典型 RNAi 的分子机制作用途径大致可分为起始阶段、效应阶段和扩增阶段 3 个阶段。
2.1 起始阶段
dsRNA 分为分子间双链和分子内双链。分子间双链是由分开的两个独立 RNA 分子互补形成，而分子内双链是由一个 RNA 分子回折，自身互补而形成。
当细胞中的 dsRNA 扩增达到一定量时，外源或内源性的 dsRNA 被一种 dsRNA 特异的核酸酶 RnaseIII家族中的 Dicer 酶特异识别，并将其逐步切割成长约21-23 nt 的 dsRNA 片 段（siRNA）。siRNA 是 RNAi作用赖以发生的重要中间效应分子，具有独特的特征性结构，其两条单链末端分别为 5'-PO3和 3'-OH,该 siRNA 与所作用的靶 mRNA 具有高度的核苷酸序列同源性。此外，由于每条 siRNA 单链的 3' 末端均有 2-3 个突出的非配对的碱基残基（图 1）[19-21],所以其化学性质相对稳定，无须像反义核苷酸那样通过大量的化学修饰来提高半衰期，这也是细胞赖以区分真正的 siRNA 和其他小 dsRNA 的结构基础。
2.2效应阶段
siRNA可与细胞质中特定的酶形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC ）， siRNA、核酸内切酶、核酸外切酶以及解旋酶是该复合体中的必备成分。在RISC的作用下，siRNA解链成为单链，由其中的反义链特异识别目的mRNA并与之结合。一经结合，细胞内的核酸内切酶就在靶mRNA的近中点位置切害」目的mRNA,被切害」的mRNA片段被核酸外切酶降解后无法正常编码成相应的蛋白质，从而导致功能缺失z3. za.
2.3扩增阶段
siRNA的反义链与靶mRNA的上游部分序列互补zs.在依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-depen-dent RNA polymerise, RdRP）的作用下，经初级阶段产生的，iRNA分子在细胞内能以自身反义链为扩增引物，以目标mRNA为模板，复制出新的dsRNA,新合成的 dsRNA 又可被降解成若干 siRNA,这种新产生的 siRNA（ 次 级 siRNA,secondarysiRNA）又可形成更多的 RISC 复合物并作用于mRNA,使 mRNA 降解。这个过程使 RNAi 效应得到放大[26,27].
3 RNAi的特点
3.1 RNAi的高度特异性
siRNA 与靶基因的 mRNA 在序列上严格遵循碱基互补配对原则，研究发现，即使发生一个碱基的错配，目的 mRNA 的沉默效率也会大大降低[28].这种高精确度的序列特异性的识别能使 dsRNA 专一地降解与之同源的 mRNA,从而精确沉默目的基因。
3.2 RNAi的高效性
细胞内的 RNAi 途径存在级联放大效应，极少量的 dsRNA 经起始阶段--效应阶段--扩增阶段的循环就能产生强烈的 RNAi 效应。靶 mRNA 被降解之后，细胞内的核糖核酸聚合酶继续催促 dsRNA的合成并反复利用该 dsRNA 进行基因沉默，以维持高效、特异靶向的干扰作用。RNAi 对基因表达的抑制率可达 90% 以上，这种高效的抑制效率是传统基因沉默实验技术所欠缺的[29,30].
