猪卵透明带3α重组乳杆菌疫苗的研发制造

　　免疫避孕是一种生育期妇女节育的重要措施。常见的免疫避孕抗原有卵细胞表面抗原、精子表面抗原、人绒毛膜促性腺激素 β 和生殖激素等，这些抗原可能干扰生育期妇女的生殖系统或免疫系统，诱发生殖功能紊乱、免疫失调、自身免疫性疾病等疾病，因此尚需研究新型疫苗。

　　乳杆菌（ Lactobacillus） 是一种革兰阳性的无芽胞需氧菌，一般呈细长的杆状，大小为（ 0. 5 ~1） μm ×（ 2 ~10） μm.常成双或短链状排列。常见菌株有干酪乳杆菌（ L. casei） 、嗜酸乳杆菌（ L. acidophilus） 、植物乳杆菌（ L. plantarum） 和约氏乳杆菌（ L. johnsonii）等，常用于食品和饲料加工业，在功能食品、医疗保健和微生态制剂等方面具有广阔的应用前景，是一种极具开发价值的疫苗载体[1 ~3],本研究拟就乳杆菌介导的猪卵透明带 3α 抗原和人绒毛膜促性腺激素 β 疫苗的构建及其作用机制等方面的研制现状进行综述。

　　1 大肠埃希菌 - 乳杆菌穿梭载体的构建

　　乳杆菌的细胞壁厚而且复杂，摄取外源 DNA 较为困难，Kim 等[4]用电穿孔方法进行外源 DNA 转化乳杆菌的试验，并摸索出了较好的转化条件，这为构建重组乳杆菌疫苗提供了有利条件。

　　为了将外源 DNA 有效引入乳杆菌，需构建大肠埃希菌 - 乳杆菌穿梭表达载体，乳杆菌的穿梭表达载体通常有组成型和诱导型两种类型。Guchte 等[5]构建的 pMG36e 是一种常见的组成型表达载体。它含有 p32 启动子及其下游部分的开放阅读框、来自pUC18 的多克隆位点和来自 PrtP 基因的转录终止子、pWV01 的复制子和氯霉素抗性基因等。尽管该载体可表达高水平的外源蛋白，但外源蛋白在细胞内的富集和聚合却可导致蛋白在胞质中被降解，通常对细胞具有毒害作用。

　　诱导型表达载体可利用诱导剂对外源蛋白进行可控性表达，因而应用较为广泛。Ruyter 等[6]开发了乳菌肽控制的表达系统（ nisin-controlled expressionsystem,NICE） .该系统含有 3 个组分： 携带 nisR 和nisK 基因的宿主菌、充当诱导分子的乳菌肽（ Nisin）以及含有 nisA 启动子的质粒。诱导剂 Nisin 诱导 ni-sA 启动子，nisA 启动子由 nisR 和 nisK 组成的双组分调节系统进行调节。nisK 是 Nisin 的膜结合感应蛋白，nisR 是膜内反应调节子。nisK 接受外源 nisin肽信号后，自身磷酸化激活胞浆内 nisR,随后 nisR激活 nisA 启动子，启动下游基因的转录和表达。宿主菌 NZ3900 含有 nisK 和 nisR 基因，质粒 pNZ8149含有 nisA 启动子，其起始密码子 ATG 处有 NCOI酶切位点，这样使插入的目的基因与 nisA 启动子的核糖体结合位点区域构成翻译融合，较转录融合具有更高的表达活性。通常将含有 nisA 启动子的质粒导入携带 nisR 和 nisK 蛋白的宿主菌时，外源基因的表达较弱，当在对数生长期加入 nisin 进行诱导后，外源基因的表达水平在一定范围内与 nisin 的剂量成正比，诱导效率可以达到 1000 倍以上[7].

　　乳杆菌的表达载体既可以利用胸苷酸合成酶（ thymidylate synthase,Thy） 或丙氨酸消旋酶（ alanineracemase,Alr） 的营养缺陷型作为选择标记，也可以利用乳糖或木糖作为选择标记。这些标记均可食用，对于口服疫苗的开发极具价值。人们发现 thyA 基因编码的 Thy 在 DNA 合成中起关键作用，缺失 thyA基因的菌株在普通培养基上不能生长，alr 基因编码的 Alr 是许多细菌生长的必需成分。Fu 等[8]以干酪乳杆菌来源的 thyA 基因作为选择标记，构建了食品级载体 pFXL103,Bron 等[9]将含异源 alr 基因的质粒 pGIPO11 转化到乳酸乳球菌 alr-菌株后，alr-菌株恢复了野生型表型。Platteeuw 等[10]构建了食品级穿梭表达载体 pLP3537,它含有 lacF 选择标记、高拷贝内源性的乳酸乳球菌 pSH71 复制子、lacA 启动子和PepN 终止子，配套菌株为删除了 lacF 基因的乳酸乳球菌 NZ3900 株，可以利用乳糖作为选择标记。将pLP3537 质粒转入 LacF 基因缺失的宿主菌 NZ3900株后，可使原来不能利用乳糖的宿主菌 NZ3900 发酵乳糖并产酸，使 pH 降低，使筛选培养基中的溴甲酚紫由紫色变为黄色，这种利用乳糖为选择标记的表达系统的元件都是食品级的，口服具有安全性。

　　Gosalbes 等[11]构建了乳糖调节的乳酸杆菌食品级表达载体 pILac.戊糖乳球菌的 MD353 染色体上含有木糖（ xylose,xy1） 编码基因，可以发酵木糖。Posno等[12]把 xy1 基因插入 pLP3537,得到食品级表达载体 pLP3537-xyl,可以利用木糖作为选择标记，这些选择标记的成功开发为发展乳杆菌成为疫苗载体提供了有力的保障。

　　2 猪卵透明带 3α 重组乳杆菌疫苗

　　猪卵透明带 3α 抗原（ porcine zona pellucid 3α，PZP3α） 是一种分子量为 73 kDa 的糖蛋白，包被于卵母细胞和着床前胚胎的表面，是一种精子特异性受体，在精卵结合和其后引发的精子顶体反应中起主要作用。Martinez 等[13]将重组 PZP3α 蛋白接种鼠猴取得了较好的避孕效果，提示它是一种有效的受精前 免 疫 避 孕 靶 抗 原。熊 亚 明 等[14]以 pVAX1-PZP3α 为模板扩增 900 bp 的 PZP3α 编码基因，插入pILac-SP 得 pILac-PZP3α； 将其电穿孔转化干酪乳杆菌 CECT5276 株，培养 48 h,免疫印渍发现兔抗PZP3α 的血清识别重组菌表达的分子量为 55 kDa 的PZP3α 蛋白， 表明该疫苗可表达具有生物活性的PZP3α 蛋白。

　　3 人绒毛膜促性腺激素 β 重组乳杆菌疫苗

　　3. 1 人绒毛膜促性腺激素 β 人绒毛膜促性腺激素β（ human chorionic gonadotropin beta-subunit,hCGβ）是人体滋养细胞分泌的妊娠特有激素，可维持并刺激妊娠黄体产生孕酮，促进蜕膜细胞发育成熟，是一种受精后免疫避孕的靶抗原。Talwar 等[15]将hCGβ 制剂接种受试妇女可诱导 hCG 抗体， 一旦hCG 抗体浓度达到 50 ng / mL 的水平时即可诱导很好的避孕效果。Kahala 等[16]发现短小乳杆菌的 S-层蛋白 A（ S-layer protein A,SLPA） 是一种分子量为 40kDa 的信号蛋白，可有效引导外源蛋白在乳杆菌的分泌表达。王红梅等[17,18]以 pBS-hCGβ 为模板扩增hCGβ 编码基因，与 SLPA 的编码基因连接后，插入pILac 得 pILac-hCGβ； 将其电穿孔转化干酪乳杆菌CECT 5276 株，0. 5% 乳糖诱导 21 h,SDS-PAGE 证实重组菌表达分子量为 22 kDa 的 hCGβ 蛋白； 将108CFU 疫苗经阴道接种 BALB / c 鼠 1 次，在初次免疫后 2 周发现免疫鼠的阴道冲洗液 sIgA 升高（ 滴度1∶12800） ,提示该疫苗可诱导小鼠产生一个有效的黏膜免疫应答。

　　姚晓英等[19 ~21]以短小乳杆菌的基因组 DNA 为模板扩增90 bp 的 SLPA 编码基因，以 pBS-hCGβ 为模板扩增 495 bp 的 hCGβ 编码基因，将 SLPA 与hCGβ 的编码基因连接后插入 pILac 得 pILac-hCGβ；将其电穿孔转化干酪乳杆菌 CECT 5276 株，培养8 h,免疫印渍发现兔抗 hCGβ 的血清识别重组菌表达的分子量为 22 kDa 的 hCGβ 蛋白； 将 109CFU 疫苗经阴道注入 BALB/c 鼠，在初次免疫后 3 周加强1 次，在初次免疫后 5 周发现阴道冲洗液 sIgA 升高，在初次免疫后 6 周发现免疫鼠的脾细胞明显增殖，并分泌高水平的 IFN-γ 和 IL-4 等细胞因子，放免试验证 实 阴 道 冲 洗 液 hCGβ 水 平 在 初 次 免 疫 后24 ~ 35 d升高，在初次免疫后 28 d 达较高水平（ 浓度15 MIU/mL） ; 同时将1010CFU 疫苗经阴道接种和灌胃分别免疫 BALB/c 鼠和 C57BL/6 鼠，在初次免疫后 3 周加强 1 次，在初次免疫后 4 周发现免疫鼠的脾细胞明显增殖，在初次免疫后 4 ~8 周发现免疫鼠的子宫和阴道冲洗液均存在 IgG 分泌细胞以及IgA 分泌细胞，提示该疫苗可诱导小鼠产生一个有效的黏膜和体液免疫应答。

　　3. 2 hCGβ-C3d3 Dempsey 等[22]认为补体片段 C3d可增加靶抗原的免疫原性，C3d3 是 3 个拷贝的C3d,与抗原共价结合后可选择性增强宿主的体液免疫应答。姚晓英等[23,24]以 phCMV1-hCGβ-C3d3 为模板扩增 hCGβ-C3d3 的编码基因，插入 pILac 得 pI-Lac-hCGβ-C3d3; 将其电穿孔转化干酪乳杆菌 CECT5276 株，0. 5% 乳糖诱导 24 h,SDS-PAGE 证实重组菌表达分子量为 220 kDa 的 hCGβ-C3d3 融合蛋白；将 1010CFU 疫苗经阴 道 分 别 接 种 BALB / c 鼠 和C57BL /6 鼠，在初次免疫后 3 周加强 1 次，在初次免疫后 2 ~8 周发现免疫鼠的血清和阴道冲洗液 IgG和 IgA 升高，脾、子宫和阴道的淋巴细胞增殖，阴道和子宫的抗体分泌细胞的数目显着增多，提示该疫苗同样可诱导小鼠产生一个有效的黏膜和体液免疫应答。

　　El-Hefnawy 等[25]发现 MLTC-1 细胞株是小鼠睾丸间质肿瘤细胞系，可表达 hCG 受体，在 hCG 刺激下可分泌孕酮。Wice 等[26]证实 Bewo 细胞株是人绒癌细胞系，具有自发融合的生物学作用，可在体外模拟体内滋养细胞的分化融合过程。王健理等[27]将1010FU 重 组 菌 LL （ pILac-hCGβ-C3d3 ） 滴 鼻 免 疫BALB / c 鼠，在初次免疫后 3 周加强 1 次，在初次免疫后 6 周发现免疫鼠的血清可抑制 hCGβ 刺激的MLTC-1 细胞株分泌孕酮， 抑制 Bewo 细胞株分泌hCGβ 以及 Bewo 细胞株融合，提示该疫苗可诱导小鼠产生具有生物活性的 hCGβ 抗体。

　　4 结 语

　　乳杆菌具有下述优点： 它是一种发酵工业长期使用的食品级益生菌，是一种公认为安全（ generallyregarded as safe,GRAS） 的微生物，易培养，基因操作简便可靠，转化效率高，重复性好； 乳杆菌是一种革兰阳性菌，不分泌内毒素，表达的外源蛋白不需纯化，可连同菌体直接服用； 乳杆菌通常不产生细胞外蛋白酶，不会在细胞外对分泌的外源蛋白进行降解； 乳杆菌通常较少分泌自身蛋白，减少了载体自身蛋白对分泌的外源蛋白的干扰； 外源蛋白既可在细胞内表达，也可在细胞壁进行表达，还可以分泌到细胞外进行表达； 乳杆菌通常具有免疫佐剂、固有免疫原性和对胆汁酸的抵抗力，可在胃肠道定植，在胃肠道的微生态平衡中具有重要作用。乳杆菌与微颗粒疫苗的大小相似，可将抗原递呈给肠黏膜组织的 M 细胞，诱导免疫应答； 口服或滴鼻接种乳杆菌可诱导宿主产生较强的黏膜免疫应答和系统性免疫应答。

　　乳杆菌具有下述缺点： 目前大部分乳杆菌表达载体常含有非食品级的基因片段，这会给乳杆菌作为活菌微生态制剂带来安全隐患； 尚未阐明乳杆菌疫苗诱导小肠产生黏膜免疫应答的机制； 尚未阐明乳杆菌疫苗的表达调控机制； 长期口服乳杆菌疫苗并不能在宿主体内表达足量的抗原； 长期低剂量口服乳杆菌疫苗有可能诱导免疫耐受； 乳杆菌疫苗的效果评价仅限于体外试验和动物试验阶段。

　　随着分子生物学和分子免疫学技术的发展，进一步筛选高表达能力的菌株可提高外源蛋白的表达水平； 针对不同的蛋白表达方式采用不同的免疫途径可提高重组乳杆菌诱导的免疫应答； 深入研究乳杆菌分泌外源蛋白的调控机制； 构建安全高效的食品级表达载体； 准确定位外源蛋白在乳杆菌中的表达位置，使重组抗原与黏膜的免疫系统充分接触；实时定量检测重组乳杆菌在宿主胃肠道表达的目的蛋白； 合理控制重组乳杆菌在胃肠道的存活时间，避免免疫耐受； 开发合适的免疫佐剂加强重组乳杆菌诱导的免疫应答。相信随着这些问题的阐明，将乳杆菌介导的免疫避孕疫苗用于生育期妇女的节育指日可待。

　　参考文献
　　
　　[1] XU Yi-gang,CUI Li-chun. Progress on Lactic acid bacteria as geneengeneering bacteria[J]. Chin J Microbiol,2007,19 （ 1 ） : 118-120. （ in Chinese）徐义刚，崔丽春。 乳酸菌作为基因工程受体菌的研究展望[J]中国微生态学杂志，2007,19（ 1） : 118-120.
　　[2] Mercenier A,Alouf HM,Grangette C. Lactic acid bacteria as livevaccines[J]. Curr Issues Mol Biol,2000,2（ 1） : 17-25.
　　[3] Seegers JFML. Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progressand prospects[J]. Trends in Biotech,2002,20（ 12） : 508-515.