评估重组BCG对EBV阳性肿瘤细胞的作用

　　EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒,属疱疹病毒科γ亚科,是重要的DNA致瘤病毒。第一次EB病毒感染大多发生在儿童时期,感染者无明显临床症状,人一旦被感染将终身带毒。在一生的任何时期体内病毒若被活化,这种病毒就可能转变为能引起肿瘤等诸多疾病的病因。研究发现,EB病毒与许多人类恶性肿瘤相关,包括胃癌、霍奇金淋巴瘤、Burkitt's淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)等。

　　本实验拟将文献构建的EB病毒融合基因重组BCG分泌型表达质粒pMV261进行体外及体内的免疫学检测,评估重组BCG对EBV阳性肿瘤细胞的作用,为应用重组BCG特异性杀伤EBV阳性肿瘤细胞提供理论依据和技术支持。

　　材料与方法
　　
　　1 材料

　　卡介苗(BCG)分泌型表达质粒pMV261为Sto-ver博士构建;EB融合基因Z2A(膜蛋白基因LMP2A与即可早期基因BZLF1融合基因)由朱伟博士构建;EB病毒阳性胃癌细胞GT39由罗兵教授馈赠。乳酸脱氢酶底物溶液购于德国Roche公司;非放射性CTL杀伤活性检测试剂盒、DNA连接酶、DNA聚合酶购于美国Promega公司;EcoRⅠ、DNA Marker、BamHⅠ、SalⅠ为博亚公司产品;T4DNA连接酶、Taq酶及各种限制性内切酶为日本TaKaRa公司产品。

　　2 方法
　　
　　2.1 Z2A基因的表达及目的蛋白检测将重组BCG和普通BCG接种于米氏培养液中,在37 ℃下振荡培养,测定不同培养时间的吸光度(A550)值。BCG培养至对数生长期,迅速转到45 ℃摇床培养,3h后收集菌体,磨砂破碎(加溶菌酶),以3 500r/min(离心半径10cm)离心10min,取上清液,用半透膜浓缩,进行8% SDS-PAGE电泳。取出凝胶,测定蛋白分子质量后电转移至PVDF膜,PVDF膜用封闭液封闭后进行Western blot。一 抗 为 用 封 闭 液1︰15稀 释 的 抗BZLF1或LMP2A抗体,二抗为HRP标记物。加入ECL显色系统显示,暗室内加X-光片曝光,观察结果。

　　2.2 小 鼠 免 疫 与 血 清 抗 体 检 测将6周 龄 雌 性BALB/c小鼠 随 机 分 为2个 免 疫 组 和2个 对 照 组(BCG对照组和PBS对照组),每组5只,每周免疫1次,共3次,间隔3周。其中第1组注射5×108个重组BCG数(100μl)/只,第2组注射重组BCG 5×107个(100μl)/只,第3组注射未重组外源片段的BCG 1×108个(100μl)/只,第4组注射无菌PBS 100μl/只。

　　免疫前、加强免疫前及末次免疫后每2周小鼠尾部采血,直至免疫后第21周为止。分离血清,采用ELISA检测特异抗体。包被抗原为LMP2A,每孔0.8μg。底物为四甲基联苯胺(3,3p,5,5p-Tetramethy lbenzi-dine,TMB)。用酶标仪测定各孔吸光度(A550)值。

　　2.3 细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)反应(乳酸脱氢酶法)将重组BCG和普通BCG接种于米氏培养液中,在37 ℃下 振 荡 培 养,测 定 不 同 时 间 的 吸 光 度(A550)值。

　　BCG培养至生长中期,迅速转到45℃摇床培养。在超净工作台过滤去除培养基,PBS冲洗2次,收集菌体,用PBS稀释成细胞数为5×108个/100μl,皮下注射免疫6~8周小鼠,试验设PBS作对照。第3、5周各加强免疫1次,共免疫3次。7周后杀死小鼠,取脾,制备淋巴细胞悬液,检测CTL对EB病毒阳性胃癌细胞GT39的杀伤率。

　　2.4 统计学方法各组数据均以x±s表示,采用SPSS10.0统计软件作t检验。以P<0.05差异有统计学意义。

　　结果
　　
　　1 Z2A基因的表达及目的蛋白的检测
　　重组BCG用米氏培养基培养后进行破菌,纯化的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转膜,进行Westernblot,结果见 图1,重 组BCG能同时表达目的蛋 白BZLF1抗体和LMP2A。

　　2 重组BCG免疫小鼠血清抗体水平
　　分别用重组BCG 5×108个/只和5×107个/只注射免疫小鼠,采用ELISA方法检定血清抗体水平,结果见图2。第一次免疫后2周,高剂量重组RCG免疫组小鼠血清抗体滴度为7 600(71.6±8.2)pg/ml,低剂量组为5 400(54.5±6.2)pg/ml,对照BCG及PBS对照株接近于0。随着免疫时间的延长,重组BCG组刺激机体产生的抗体增长较快,至免疫后第6周,高剂量组抗体滴度达17 600(186.5±6.7)pg/ml,低剂量组为13 500(136±6.2)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。

　　3 免疫小鼠的CTL反应
　　试验分重组BCG组、BCG对照组和PBS对照组,每组5只小鼠。CTL反应结果见图3,重组BCG感染能激发小鼠脾脏CTL反应,其中BCG对照组及PBS对照组对GT39细胞的杀伤率分别为(32.5±2.7)%和(22.8±2.3)%,而重组BCG组为(62.7±6.2)%。其差异具有明显显着性(P<0.05)。其差异具有明显显着性(P<0.05)。
　　
　　讨论

　　在预防EB病毒感染的多种措施中,接种疫苗是重要手段之一。本研究采用的重组BCG含有EB病毒BZLFl与LMP2A融合基因Z2A,含有pMVZ2A的BCG细胞能同时分泌表达BZLFl与LMP2A蛋白。LMP2A含有能被具有MHC限制性、病毒特异性CTL识别的抗原,能介导CTL发挥作用,是较为理想的靶抗原。对于EB病毒相关肿瘤,LMP2A是免疫治疗效果理想的靶抗原。研究发现,体内外所有EB病毒潜伏感染的B细胞中均有LMP2A表达,约50%的EBV相关胃 癌 组 织LMP2A阳 性,而 且LMP2A还是鼻咽癌等肿瘤细胞稳定表达的少数保守抗原,有T细胞激活表位,能介导CTL细胞发挥活性。LMP2A本身是安全的,在肿瘤细胞中能稳定表达,具有潜在的限制性T细胞表位,能诱导杀伤性T细胞,最重要的是表达LMP2A的基因没有转化作用,不能导致细胞癌变。Redchenko等曾用负载LMP2A表面多肽的DC免疫诱导强烈的杀伤性T细胞应答。作者前期研究表明,该基因在含EB病毒肿瘤细胞中表达的LMP2A可诱导产生特异性杀伤性T细胞,表达的BZLFI可诱导潜伏期EB病毒进入裂解复制期,从而杀伤含EB病毒肿瘤细胞。BCG被用作减毒活疫苗已有近百年。

　　BCG作为疫苗载体有以下优点:

　　1)低毒性,很少导致不良反应;2)不会影响母体抗体;3)较耐热,是常用的一种疫苗;4)BCG接种产生的免疫力可长时间保持;5)对实验动物和人都是较强佐剂,可作用于巨噬细胞和APC,调节Th1型与Th2型细胞的比例。

　　本研究对重组BCG表达产物进行Western blot分析,显示BZLFl和LMP2A两种蛋白均有表达。小鼠体液免疫和细胞免疫试验结果表明,重组蛋白能刺激机体产生抗体,且重组BCG 5×108个/只免疫组抗体水平高于5×107个/只免疫组。至于是否接种菌数越多抗体含量抗高,有待进一步研究。免疫小鼠的CTL试验表明,重组BCG感染鼠的脾淋巴细胞可有效激发CTL反应,但效应细胞和目的细胞的比例对其裂解效果影响不大。

　　以上实验结果表明,Z2A导入BCG后构建的重组BCG能够在小鼠体内表达目的蛋白并能有效激发CTL反应,为临床应用含融合基因的BCG载体预防EB病毒相关肿瘤及结核分枝杆菌感染奠定了基础。