HPIV-3的病毒学特点与预防性免疫

　　人 3 型副流感病毒（ Human Parainfluenza Virustype 3,HPIV-3） 是 Chanock 等人于 1957 年从华盛顿一名患有急性呼吸道疾病的 2 岁患儿的咽拭子中分离出的，早期的研究发现其许多流行病学和传播特征与流感病毒相似，但进一步的病毒学研究发现，它是一种与流感病毒完全不同的呼吸道病毒，故将其划分到副粘病毒科（ Paramyxoviridae）[1].大量研究证明，HPIV-3 是仅次于呼吸道合胞病毒（ Respiratorysyncytical virus,RSV） 的可引起婴幼儿、老年人及免疫力低下患者严重下呼吸道疾病的病原体。据估计，在发达国家每年由于 HPIV-3 感染导致的住院人数最高可以达到数万人，造成了很大的疾病负担；在发展中国家，由 HPIV-3 导致的下呼吸道感染疾病是引起婴幼儿死亡的重要原因[2].对于 HPIV-3感染的预防和治疗，目前还没有特效的疫苗和药物，因此，WHO 将 HPIV-3 疫苗列为未来重点研发的疫苗。目前，对 HPIV-3 的流行病学、结构特征和致病机制等基础性研究已较为成熟，但对 HPIV-3 的感染仍缺乏有效的治疗药物和预防性疫苗，而研发新型抗病毒药物和安全有效的 HPIV-3 疫苗成为现今学术界的研究热点。本文就 HPIV-3 的病毒学基础、流行病学特点、致病特征及近年来预防性疫苗研究进展等方面进行综述。

　　1 HPIV-3 的生物学特性

　　1. 1 HPIV-3 的结构特征 HPIV-3 属于副粘病毒科，呼吸道病毒属。其生物学特性与副粘病毒相似，具有副粘病毒典型的结构特征。它是一种有包膜的单负链 RNA 病毒，在电镜下呈以球形为主的多形性，其病毒颗粒直径一般为 120 ~180 nm,核衣壳呈螺旋对称形。

　　HPIV-3 基因组全长约 15 400 bp,依次编码 6 种蛋白： 核衣壳蛋白（ NP） 、磷蛋白（ P） 、基质蛋白（ M） 、融合蛋白（ F） 、血凝素-神经氨酸酶（ HN） 和大分子蛋白（ L）[2].这 6 种蛋白以 3'-NP-P-M-F-HN-L-5‘的顺序排列在其负链 RNA 的基因组中[3].

　　病毒包膜由脂质和糖蛋白组成。包膜外表面存在两种主要与病毒毒力相关的糖蛋白： 血凝素-神经氨酸酶（ HN） 和融合蛋白（ F） .其中 HN 蛋白属于II 型膜融合糖蛋白[4]（ N 端在胞内，C 端在胞外） ,具有红细胞凝集活性、神经氨酸酶活性、受体识别活性以及促细胞融合作用[5].Takimoto 等[6]对 HN 蛋白介导细胞融合机制的研究发现，HN 蛋白头部及躯干区域的完整性对其神经氨酸酶活性及受体识别活性有很大影响； 褚福禄等[5]的研究发现，HN 蛋白的糖基化及其 N-糖链的完整性对 HN 蛋白的折叠、生物学活性有重要作用。另一种包膜糖蛋白是 F 蛋白，属于 I 型糖蛋白（ C 端在胞内，N 端在胞外） ,具有促进细胞融合和溶血的作用。对 F 蛋白裂解位点的研究发现，裂解位点中碱性氨基酸残基的比例与病毒的裂解能力及毒力成正相关[3].这两种蛋白都与病毒感染密切相关，它们相互作用，在病毒吸附靶细胞表面和侵入靶细胞的过程中起决定性作用。因此所有基因型的人副流感病毒 （ HumanParainfluenza Virus,HPIV） 的致病性和免疫原性等重要生物学特性，都取决于其 HN 和 F 蛋白的结构和功能。同时针对这两种蛋白的抗体对病毒具有中和作用，因此 HN 和 F 蛋白是疫苗研究的主要靶蛋白[7].目前，对 HPIV-3 的这两种蛋白分子的研究已相当深入，这对 HPIV-3 反向遗传学疫苗及亚单位疫苗的开发奠定了坚实的理论基础。病毒包膜内表面还存在非糖基化的内膜基质蛋白（ M） ,与病毒的装配和释放有关，在保护病毒内膜的完整性中起到关键作用[8].另外三种蛋白 NP、P 和 L 是与病毒基因组 RNA（ vRNA） 有关的非结构蛋白。这 3 种蛋白质可与vRNA 结合形成病毒核糖核蛋白复合体，参与病毒RNA 的转录和复制[9],NP 蛋白可绑定在 vRNA 上，为 L 和 P 蛋白的转录提供模板[1].

　　除了表达这 6 种必需的蛋白质外，每个基因型的 HPIV 都可从 P 基因的开放性阅读框中至少表达出另外一种具有一定功能的其他蛋白质。例如，HPIV-3 及 HPIV-1 可编码一种短的 C 蛋白，该蛋白可增强病毒抗 I 型干扰素反应的能力，使得病毒在机体内有效复制，同时对病毒在机体内的免疫逃逸作用有一定影响； 而 HPIV-2 可编码另一种 V 蛋白，其 C 末端包含一个富含半胱氨酸残基的保守区域[10],近期研究发现，V 蛋白可与 NP 蛋白结合，在病毒复制中起调节作用，同时 V 蛋白也可通过延长细胞凋亡周期使病毒大量复制[9].

　　1. 2 HPIV-3 的复制过程 HPIV-3 感染宿主细胞的第一步是将病毒粒子上的 HN 蛋白绑定在宿主细胞膜蛋白的唾液酸受体上，接着 F 蛋白介导病毒包膜与宿主细胞膜融合，促使病毒进入宿主细胞。但融合过程也受到以下两方面的限制，二者缺一不可： ① F 蛋白必须在同源 HN 蛋白的协助下才能激发其融合活性，才能进一步完成融合过程； ② 同时，在 F 与同源HN 相互作用的过程中，F 蛋白必须经过宿主细胞水解酶作用，使其裂解为由两个二硫键连接的亚单位F1、F2 后，F 蛋白才具有融合活性，如果宿主细胞中缺乏这种水解酶，就会产生非感染型病毒，使病毒难以复制[8].膜融合过程释放出核衣壳，使病毒基因组进一步复制。由于 HPIV-3 中的负链 RNA 不能直接行使 mRNA 的功能，因此该负链 RNA 需经病毒特异性RNA 依赖的 RNA 聚合酶在起始基因和终止基因信号的指导下，先合成一个单独的 mRNA 链，再以其为模板合成新的负链 RNA,病毒基因组则以此种方式循环复制。同时细胞内的核糖体可翻译病毒 mRNA合成相关蛋白。复制出的子代 RNA 由 NP 蛋白紧密包裹形成核衣壳后，再聚集、组装成病毒颗粒，从在宿主细胞膜上通过出芽方式释放到细胞外。感染过程中形成的子代 HPIV-3 病毒，通常可由有纤毛的呼吸道细胞表面释放到呼吸道内腔中，这种定向芽生作用通常也将 HPIV-3 的感染仅局限于呼吸道中。但对于免疫功能低下的患者，HPIV-3 感染通常会引起严重的全身性感染[8 -10].

　　1. 3 HPIV-3 的流行病学特征 HPIV 是常见的社区获得性呼吸道感染的病原体，它的流行不受种族、社会经济条件、性别、年龄和地理位置的限制，呈全球性分布。其可引起多种临床综合征，如反复发作的轻微上呼吸道感染或更严重的下呼吸道感染。

　　HPIV 根据抗原性及血清型不同，可分为 4 个血清型及 2 个血清亚型（ HPIV-1、2、3、4、4a 和 4b） .虽然各型别的结构和生物学特征相似，但其最适感染人群、流行病学特征和所引发的临床疾病等都有很大差异[11].HPIV-1 和 HPIV-2 主要引起交替出现的流行性感染，在小儿的喉炎病例中，由它们引起的感染占 30% ~ 50%.HPIV-3 常在春夏两季暴发，通常引起婴幼儿的下呼吸道感染，是仅次于RSV 的引起 6 个月以下婴幼儿细支气管炎和肺炎的第二大病原体。据估计，在住院治疗的下呼吸道感染的婴幼儿中，约 12% 由 HPIV-3 病毒感染引起。

　　HPIV-4 是最不常见的血清型，通常感染年龄较大的儿童及老年人[12].在 HPIV 的 4 个血清型中，HPIV-3 是可引起婴幼儿下呼吸道严重疾病的病原体，在全球范围内造成沉重的疾病负担和死亡。它主要引起 1 岁以内婴幼儿的肺炎和支气管炎，是引起婴幼儿死亡的重要原因； HPIV-3 还是导致老年人、慢性病患者和免疫力低下的成年人（ 例如器官移植、HIV 患者等） 下呼吸道疾病的重要病原体，尤其是实质性器官移植或造血干细胞移植的病人，经常伴有严重的 HPIV-3感染性疾病，其中约 55% 可发展为肺炎，病死率达到 27%[12].

　　在美国，每 1 000 个儿童中就有约 8 人因 HPIV感染进行住院治疗，其中 2 岁以下的婴幼儿占到了约75% .一项来自 New Vaccine Surveillance Network（ NVSN） 历时近 4 年（ 2000 年10 月-2004 年9 月） 的调查结果显示[13],在因发热和急性呼吸道疾病而住院治疗的≤5 岁的儿童（ 近 2 800 人） 中，约 190 人由HPIV 感染所引起，占到了近 7% ,其中因 HPIV-3 感染的儿童占到 50%.张鹏等[14]对中国 2009-2011年的 HPIV-3 型的流行病学做了调查，甘肃省和陕西省的719 例患有急性呼吸道感染疾病的儿童中共检测出67 份 HPIV 阳性标本，其中 HPIV-3 感染儿童50人，占到了 HPIV 感染者的约 75%,与其他呼吸道病毒发生共同感染的 HPIV-3 阳性标本30 份，在 HPIV-3 引起的呼吸道感染中，7 岁以下的患者占感染总人数的 40%.刁娟娟等[15]对国内济南、沈阳及南京地区 2009 年4 月-2011 年1 月的 973 例小儿急性上呼吸道感染疾病患者做了调查，结果显示这些患儿中有5. 65% 感染了 HPIV.机体对 HPIV-3 的感染不能产生持久、有效的免疫保护，因此，此病毒感染可终生发生； 而 HPIV-3所引起的临床症状与流感相似，不能使所有该病毒感染者都得到明确的病毒学检查，这也成为了HPIV-3 流行病学调查的首要限制因素。

　　1. 4 HPIV-3 感染的免疫应答机制 机体预防HPIV-3 的感染通常涉及体液免疫和细胞免疫[12].

　　机体自然感染 HPIV-3 后产生的黏膜分泌型 IgA可中和病毒，在阻断子代病毒由上皮细胞表面到呼吸道腔内的定向芽生的过程中起到一定作用，因此可保护上、下呼吸道免受感染； 血清中产生的针对两种病毒表面糖蛋白 HN、F 的 IgG 抗体对 HPIV-3 具有中和活性，高滴度的血清抗体在长期保护机体免受 HPIV-3 的感染中发挥重要作用。机体对病毒编码的其他蛋白，如 P 蛋白，所产生的抗体也具有保护机体免受HPIV 感染的特性[10].因此，黏膜和鼻腔细胞中产生的局部抗体及血清中的全身性抗体都对机体的保护性应答具有重要作用。在疫苗的实验室研究中，黏膜抗体也已成为评价疫苗免疫效力的一项重要指标[16],因此有效的 HPIV-3 疫苗必须能在机体内引发全身或局部黏膜的中和抗体应答。

　　HPIV-3 的 HN、P 和 NP 蛋白中均存在 T 细胞表位，其介导的细胞毒性 T 淋巴细胞的免疫应答在清除下呼吸道病原体、保护机体免受再次感染的过程中起到主要作用[17].在受 HPIV 感染的患者的肺部都可检测到白细胞介素-2（ IL-2） 、IL-6、IL-10、γ-干扰素（ IFN-γ） 和肿瘤坏死因子-ɑ（ TNF-ɑ） 等炎性因子的分泌。在机体的细胞免疫应答过程中，细胞毒性 CD4 +T 细胞和 CD8 +T 细胞起到关键作用。

　　HPIV-3 感染所激发的 CD4 +T 细胞可通过分泌细胞因子，对适应性免疫应答进行间接调控，包括 B 细胞分化的应答修饰、巨噬细胞活化、CD8 +记忆性 T细胞应答以及在病原体清除后下调应答反应的过程中都起到重要作用； 也可通过分化为具有分泌不同细胞因子功能的子细胞系从而抵御不同的病原体感染[18].HPIV-3 感染使得 CD8 +T 细胞通过激活树突状细胞、活化受感染的宿主细胞的杀伤性来清除病原体。在 HPIV-3 感染过程中，机体也可通过精密的细胞免疫调节机制，最大程度降低病毒所引起的病理损伤： 例如在机体感染 HPIV-3 后，诱导CD4 +T 细胞分泌的各种炎性因子可阻断 HPIV-3 病毒的转录过程； 而由 HPIV-3 感染所激发的 T 细胞可同时分泌 IL-10,抑制 II 型主要组织相容性复合体抗原（ MHC-II） 在抗原提呈细胞中的表达，从而下调 T 细胞的增殖性反应，保护 T 细胞免受由病毒感染引起的细胞凋亡[2].可见，有效的 HPIV-3 疫苗除能在体内引发中和抗体外，也要能诱导产生可分泌 IL-2、TNF-ɑ 和IFN-γ 的多能 CD4 +T 细胞[19].