观察胶原蛋白对成纤维增殖及小鼠伤口愈合的影响

时间：2014-08-27 来源：未知作者：傻傻地鱼本文字数：4295字

　　皮肤损伤创面治疗是临床常见问题,如患者伴有免疫功能低下及糖尿病等疾病,伤口通常较难愈合,如何促进创面愈合并提高愈合质量一直是研究的热点。创伤修复是由多种细胞、细胞因子参与、且相互作用的复杂过程,胶原蛋白作为细胞外基质重要组成成分可促进多种细胞如成纤维细胞、内皮细胞的迁移、分化和增殖,并可促进生长因子等细胞因子的产生,促进伤口愈合。Chai 等发现,将荧光标记的鱼鳞胶原蛋白置于小鼠皮肤表面,鱼鳞胶原蛋白可透过皮肤角质层,并可活化成纤维细胞,增强皮肤的弹性及保湿性。Castillo-Briceo 等研究发现: 胶原蛋白中的 GFOGER、GLOGEN 结构域可促进成纤维细胞的黏附、增殖及 IL-1β 基因的表达。利用胶原蛋白胶制成的敷料治疗糖尿病小鼠皮肤溃疡,治疗第 7 天,可使伤口缩小 62%。目前,天然胶原蛋白主要来源于畜类及禽类动物组织,但由于疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发,使陆生哺乳动物胶原蛋白的安全性普遍受到质疑。我国水产品丰富,在加工鱼产品同时产生大量下脚料,其中鱼鳞约占总质量 5%,通常被当作垃圾丢弃,我国每年丢弃的鱼鳞约有 30 万吨。蛋白质是鱼鳞的主要成分,约占总重的 70%,其中主要是胶原蛋白和鱼鳞硬蛋白。本室的前期工作表明,水提法提取的鱼鳞胶原蛋白可清除氧自由基,提高超氧化物歧化酶( superoxide dismutase,SOD) 、过氧化氢酶( catalase,CAT) 含量,具有良好的生物学活性。在此基础上,本研究利用水提法提取鱼鳞胶原蛋白,观察胶原蛋白对成纤维增殖及对免疫功能低下小鼠伤口愈合的影响,为鱼鳞胶原蛋白开发利用及损伤修复治疗研究奠定基础。

　　1、材料与方法

　　1. 1 材料

　　鱼鳞取自牡丹江市新玛特超市( 新鲜的各种鱼鳞混合物) 。BALB/C 小鼠,雌雄各半,体重 18 ~20 g; 3 日龄内 Wsitar 乳鼠,由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供。RPMI 1640 培养基为Gibco公司产品,ELISA 试剂盒为 RD 公司产品,引物由上海生工生物工程有限公司合成,SYBR PremixEx TaqTM为 TaKaRa 公司产品。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 鱼鳞胶原蛋白膜制备: ①鱼鳞前处理: 新鲜鱼鳞清水冲洗→烘干→1%盐酸溶液脱钙→清水、蒸馏水冲洗→调 pH 值→烘干,备用。②水提法制备鱼鳞胶原蛋白膜: 取适量经处理鱼鳞,捣碎,按 1∶ 30比例加入蒸馏水,100 ℃ 水浴 30 min,80 ℃ 水浴1. 5 h,4 ℃ 、8 000 r / min 离心 20 min,取上清,经0. 45 μm 滤膜过滤除菌后,于超净台内自然干燥后即得鱼鳞胶原蛋白膜。③胶原蛋白含量测定: 采用对二甲基氨基苯甲醛比色法测定胶原蛋白特征氨基酸-羟脯氨酸的含量,测得值 × 11. 1 即为胶原蛋白的量。提取率 = 提取的胶原蛋白量/鱼鳞中总的胶原蛋白量 ×100%。

　　1. 2. 2 鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响: 大鼠真皮成纤维细胞分离: 取 3 日龄内的Wsitar 乳鼠背部皮肤,加入 0. 25% 中性蛋白酶溶液,4 ℃ 酶解消化过夜,分离真皮、表皮。将真皮部分加入0. 25%的Ⅰ型胶原酶37 ℃酶解消化1 h。PBS 溶液洗涤离心、200 目细胞筛过滤去除基质成分,得到的细胞为大鼠真皮成纤维细胞。MTT 法检测鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响:取适量无菌胶原蛋白膜,用 1640 培养液溶解制成浓度为 5、10、20、40 mg/L 液体,与生长状态良好的大鼠真皮成纤维细胞 4 × 103个共同培养于 96 孔板中,未加胶原蛋白孔为空白对照。培养 48 h 后,每孔加入 MTT 溶液( 5 g/L) 20 μL,继续培养 4 h。弃上清,每孔加入 DMSO 溶液 150 μL,振荡 10 min,于490 nm 处检测吸光度( OD) 值。增殖率 E( % ) 按以下公式计算。E( %) = ( A样品- A0) /A0× 100% ( A0为空白对照组吸光度值; A样品为胶原蛋白组吸光度值) 。

　　1. 2. 3 免疫低下小鼠皮肤损伤模型制备: 利用环磷酰胺诱导小鼠免疫低下。将小鼠腹腔注射环磷酰胺50 mg / kg,每天 1 次,连续 2 天,建立小鼠免疫低下模型。随机取正常小鼠 10 只,作为正常组; 取免疫低下小鼠40 只,随机分为4 组( 模型组、鱼鳞胶原蛋白 1 mg、0. 5 mg、0. 25 mg 组) 。乙醚麻醉,背部去毛,消毒,用特制打孔器在小鼠背部打一直径为1 cm 的圆形孔,切除皮肤全层。造模第 1 天,正常组、模型组伤口处覆盖无菌纱布,鱼鳞胶原蛋白组伤口处覆盖含量为 1 mg、0. 5 mg、0. 25 mg 的鱼鳞胶原蛋白膜,每日更换纱布及给药 1 次,观察伤口愈合情况,并将创面描记在半透明纸上,计算创面面积大小,按以下公式计算创面愈合率,创面愈合率( %)= ( 开始创伤面积 - 未愈合创面面积) / 开始创伤面积。

　　1. 2. 3. 1 检测 PDGF、TGFβ mRNA 表达: 皮肤损伤后第 5、7、10 天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白 1 mg 组、正常组伤口组织,匀浆器研磨,利用 Trizol 试剂法提取 RNA。取 1 μg RNA 利用 M-MLV 逆转录酶法合成 cDNA。PCR 采用 SYBR Green 染料法,PDGF 上游引物为 5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3',下游引物为 5'-TTGGCCACCTTGACGCTGCCG-3'。TGFβ上游引物为 5'-GCTAATGTTGTTGCCCTCCTAC-3',下游引物为 5'-GGACTTTGGTGTGTTGAGTGTC-3'。

　　PCR 反应条件为: 50 ℃ ,2 min,94 ℃ ,10 min,1 循环; 94 ℃,15 s,60 ℃,1 min,40 循环。以 GADPH 为内参基因,用 2- ΔΔCt法处理数据。

　　1. 2. 3. 2 检测 PDGF、TGFβ 含量: 皮肤损伤后第 5、7、10 天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白 1 mg 组、正常组伤口组织,加适量生理盐水将组织捣碎,4 ℃、7 500 r / min离心 15 min,取上清,按说明书 ELISA检测 PDGF、TGFβ 含量。

　　1. 2. 3. 3 流式细胞术检测伤口处 M2 型巨噬细胞含量: 皮肤损伤后第 10 天切取模型组、鱼鳞胶原蛋白 1 mg 组、正常组伤口组织,用适量生理盐水冲洗后,放入含有 0. 1% 胶原酶,300 U/mL DNAase 的PBS 中 37 ℃ 消化 90 min,离心取上清,用 40% /70%不同密度的淋巴细胞分层液梯度离心,即可得到巨噬细胞。将巨噬细胞与 FITC 标记的抗小鼠 F4/80、PE 标记的抗小鼠 CD206 抗体4 ℃ 共同孵育 30 min,PBS 洗涤后,上机检测。

　　1. 3 统计学处理。

　　应用 SPSS 17. 0 软件,通过 t 检验进行统计学分析,数据以珋x ± s 表示,P < 0. 05 为差异有显著性意义,P <0. 01 为差异具有非常显著性意义。

　　2、结果

　　2. 1 鱼鳞胶原蛋白对大鼠真皮成纤维细胞增殖的影响

　　实验结果显示,鱼鳞胶原蛋白无细胞毒性、具有良好的促进成纤维细胞增殖作用,并呈一定剂量依赖关系,当鱼鳞胶原蛋白浓度达到40 mg/L 时,增殖率可达 38. 65%( 图 1) 。

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　　2. 2 鱼鳞胶原蛋白对伤口愈合率的影响

　　与正常组相比,免疫低下小鼠伤口愈合明显迟缓,造模第 5 天,正常组的愈合率达到 25. 15%。而免疫低下小鼠的愈合率仅为 8. 34%。鱼鳞胶原蛋白具有良好的组织相容性,无细胞毒性作用,将鱼鳞胶原蛋白膜覆盖在伤口上,明显促进了免疫低下小鼠伤口愈合。与模型组相比,造模第 5 天,鱼鳞胶原蛋白 1 mg 组即明显促进了伤口愈合,愈合率已达18. 19% ( P < 0. 01) 。第 10 天,0. 5 mg 鱼鳞胶原蛋白组可明显促进伤口愈合( P < 0. 05) ,愈合率达57. 37% ,1 mg 鱼鳞胶原蛋白组愈合率已接近正常组。第 15 天,1 mg 组愈合率已达到 96. 34%。鱼鳞胶原蛋白 0. 25 mg 组促愈合作用无显著性差异( 图2) 。

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　　2. 3 鱼鳞胶原蛋白对伤口处 PDGF mRNA 表达及合成的影响

　　实验结果显示,与模型组相比,造模第 5 天,鱼鳞胶原蛋白 1 mg 治疗剂量即可促进伤口处 PDGFmRNA 表达。造模第 10 天,PDGF mRNA 表达水平接近正常组( 胶原蛋白组 PDGF mRNA 表达量是模型组的 2. 31 倍,正常组的表达量是模型组的 2. 38倍,图 3) 。ELISA 检测结果( 图 4) 进一步表明鱼鳞胶原蛋白可促进 PDGF 蛋白合成。

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　　2. 4 鱼鳞胶原蛋白对伤口处 TGFβ mRNA 表达及合成的影响

　　实验结果显示,与模型组相比,鱼鳞胶原蛋白1 mg治疗剂量可促进伤口处 TGFβ mRNA 表达,造模第 10 天,TGFβ mRNA 表达水平接近正常组( 胶原蛋白组 TGFβ mRNA 表达量是模型组的 2. 29 倍,正常组的表达量是模型组的 2. 38 倍,图 5) 。ELISA检测结果( 图 6) 进一步表明,鱼鳞胶原蛋白可通过促进 TGFβ 表达及合成,促进免疫低下小鼠伤口愈合。

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　　2. 5 鱼鳞胶原蛋白对伤口处 M2 型巨噬细胞含量的影响

　　实验结果显示,与模型组相比,鱼鳞胶原蛋白1 mg治疗剂量可促进巨噬细胞向伤口处聚集及向M2 巨噬细胞转化。造模第 10 天,鱼鳞胶原蛋白组伤口处巨噬细胞中M2型巨噬细胞含量可达38. 57% ,而模型组的含量仅为 25. 26% ( 图 7) 。

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　　3、讨论

　　胶原蛋白是细胞外基质重要组成成分,在损伤修复过程中发挥重要作用。目前,天然胶原蛋白提取的主要方法为酸法及酶法,但该提取方法时间长,成本高,且大量腐蚀性物质对生产设备要求较高,不适合大规模生产。本室前期工作表明: 与酸法相比,水提法同样可以有效的提取鱼鳞胶原蛋白,且提取的胶原蛋白具有良好的清除氧自由基,提高SOD、CAT 含量作用。本研究采用水提法提取鱼鳞胶原蛋白,观察对免疫低下小鼠伤口愈合作用。

　　成纤维细胞是构成肉芽组织的主要成分之一,能合成、分泌大量胶原蛋白、纤维连接蛋白等细胞外基质,为表皮细胞的覆盖创造条件,还可分泌PDGF、TGFβ、FGF 等多种细胞因子,通过多途径参与修复过程。本研究利用原代培养的大鼠真皮成纤维细胞,观察鱼鳞胶原蛋白对成纤维细胞增殖的影响。结果表明: 水提法提取的鱼鳞胶原蛋白具有良好的生物相容性,可以剂量依赖的方式促进成纤维细胞增殖,当浓度达到 40 mg/L 时,增殖率可达38. 65% 。

　　组织损伤修复是由多种细胞、因子参与的复杂过程。PDGF、TGFβ、FGF 等因子可通过多途径调控修复过程,促进伤口愈合。PDGF 是第一个批准临床用于治疗皮肤损伤的细胞因子,Nagai 等、Man-dracchia 等用 Becaplermin( 重组人 PDGF) 治疗糖尿病患者的皮肤溃疡,发现 Becaplermin 可促进细胞的迁移、增殖,促进细胞因子的产生,促进伤口愈合。

　　在证实鱼鳞胶原蛋白可促进成纤维细胞增殖、促进小鼠皮肤伤口愈合基础上,观察胶原蛋白对 PDGF、TGFβ mRNA 表达及蛋白合成的影响。 Real timePCR 检测结果表明: 胶原蛋白 1 mg 治疗剂量在治疗早期,第 5 天即可促进 PDGF、TGFβ mRNA 表达,表达量分别为模型组的 1. 52 倍、1. 34 倍。治疗第 10天,表达量已接近正常组。ELISA 检测结果进一步证实: 胶原蛋白可促进伤口处 PDGF、TGFβ 蛋白合成。因此,鱼鳞胶原蛋白可通过促进伤口处 PDGF、TGFβ mRNA 表达及蛋白合成,促进伤口愈合。巨噬细胞在组织损伤修复中发挥重要作用。巨噬细胞功能具有可塑性及多样性,随微环境变化发生极化从而表现出不同的巨噬细胞亚型。M2 型巨噬细胞可大量分泌 IL-10、TGFβ、PDGF 等因子,抑制炎症反应,参与组织损伤修复等过程。为进一步证实鱼鳞胶原蛋白促进免疫低下小鼠伤口愈合的作用,利用流式检测了伤口处 M2 型巨噬细胞含量,结果表明: 鱼鳞胶原蛋白可明显促进巨噬细胞向伤口处聚集及向 M2 型转化,可通过提高巨噬细胞活性,促进伤口愈合。

　　本研究结果表明,水提法提取的鱼鳞胶原蛋白具有良好的生物相容性,可通过促进成纤维细胞增殖,促进 PDGF、TGFβ mRNA 表达及蛋白合成,提高M2 型巨噬细胞含量,促进免疫低下小鼠伤口愈合,其临床应用价值值得进一步深入研究。

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