3 型肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的合成

　　肺炎球菌感染是在全球范围内引起死亡的重要原因之一，且是肺炎、脑膜炎、中耳炎的主要病因[1].美国有观察资料显示，估计每年有40 ~50 万人患肺炎球菌性肺炎，病死率为 5% ~ 10%.在用疫苗可预防儿童死亡的疾病中，肺炎球菌引起的疾病排名第一[2,3].随着抗菌素的大量使用，耐药菌株与日俱增，医学界再次关注疫苗的研发[4].研究中发现抗表面的荚膜多糖能够保护机体对抗细菌感染，那么用多糖来制备疫苗的想法自然成形[5,6].由于多糖是非胸腺依赖性（ TI） 抗原，再次免疫不能使降低的抗体达到初次免疫的水平，不能诱导免疫记忆细胞的产生，且对婴幼儿和老人几乎没有保护作用，而该年龄段人群是肺炎球菌感染的高危人群。

　　但是将肺炎球菌多糖共价连接到蛋白却使之成为胸腺依赖性（ TD） 抗原，能够对婴幼儿和老人产生抗体，免疫效果得到提高[7,8].2000 年惠氏成功研制出 7 价肺炎结合疫苗，包含血清型 4、6B、9V、14、18C、19F 和 23F,接种 PCV7可以预防疫苗所覆盖 7 种血清型所导致的 IPD,约占所有 IPD 的80%左右。但 PCV7 不能预防疫苗血清型覆盖之外的其他血清型肺炎球菌的感染[9].2010 年惠氏上市的 13 价肺炎结合疫苗新增包括 3型在内的其他 6 种血清型[10].GSK 研制的肺炎结合疫苗原本计划中有 3 型血清型的研究，但是最后上市的 10 价结合疫苗产品中放弃加入 3 型血清型。根据亚洲肺炎流行血清型的调查，除了 7 价包含的7 种血清型以外，3 型血清型肺炎的发病率很高，达到了 6. 2%[11,12].而在我国目前肺炎结合疫苗的接种人群注射还很大程度上依赖于国外产品，成本很高，接种完成要付出几千元的高额费用，使很多潜在患者望而却步，起不到全民预防的作用。所以研究我国肺炎高发流行血清型结合疫苗，形成和国外产品的竞争，解决接种肺炎过程带来的高消费问题，已刻不容缓。

　　因地域和个体的不同，肺炎高发血清型在各个国家和地区都存在差异。目前国内没有自己正式上市的肺炎结合疫苗产品，所以血清型的工艺路线研究显得格外重要。本实验选取了在亚洲地区发病率很高的 3 型肺炎血清型进行工艺路线研究。3 型多糖是由两个单糖的重复单位组成：→4） -β-D-Glcp-（ 1→3） -β-D-Glcp A-（ 1→。活化过程中，活化度的控制至关重要。活化度是多糖和氧化产生的醛基比例关系。活化度太大，氧化的醛基少，不利于蛋白的结合。活化度太小，反应剧烈容易发生交联。结合过程中，投料比、结合比的控制对于结合收率的影响以及免疫原型也至关重要。工艺路线的关键之处在于载体蛋白的选择。本实验选择 CRM197 作为载体蛋白，CRM197 是一种白喉毒素突变体，具有其全长序列，是将其第 52 位 Gly 突变为 Glu,丧失了毒素的毒性和酶活性，保留了其免疫原性，克服了类毒素作为载体蛋白因为脱毒不彻底会产生毒性的潜在危险性[13].通过本实验的初步研究，经过长期不同条件的优化，将 3 型肺炎球菌多糖与 CRM197 共价偶联，最终能够在小鼠体内引发很好的免疫反应。

　　1 材料与方法

　　1. 1 实验材料 3 型肺炎球菌多糖、CRM197（ 天津康希诺生物技术有限公司提供） ,氰基硼氢化钠（ Sigma 公司） ,辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG抗体（ Sigma 公司） ,96 孔酶标板（ 通派生物科技有限公司） ,氢氧化铝佐剂（ 国药集团化学试剂有限公司） .

　　1. 2 实验动物 BALB /c 小鼠，SPF 级； 由具有动物生产资格证的繁育基地提供，并附带合格证。实验开始前 2 ~3 d,由具有动物使用资格证的研究单位进行检疫，淘汰检疫不合格动物。动物体重 12 ~14g; 同组幼小鼠体重不超过或不低于同性别动物平均体重的 20%.试验用 100 只，雌性小鼠。

　　1. 3 方法
　　
　　1. 3. 1 3 型肺炎多糖活化 由于 3 型肺炎多糖黏度大，不利于活化，所以使用前，用 0. 2 mol/L 乙酸在85 ℃水解预处理1 h,减小多糖分子片段，降低分子量，降低黏度，利于活化的进行。温度降低至 20℃ 后加入 0. 1 mol / L 氯化镁。再加入一定量的高碘酸钠氧化多糖，使其在邻位羟基处产生醛基，在 23℃ 下避光反应 19 h.反应结束后，通过 100 K 的膜包用纯化水对活化多糖超滤 10 次以上。超滤结束后，在超净台用 0. 22 μm 囊式过滤器过滤。然后用0. 2 mol / L pH7. 0 的磷酸缓冲液调节活化多糖 pH至 6. 5,加入载体蛋白使其慢慢溶解，之后，再加入25 倍于 3 型多糖含量的蔗糖，溶解后倒入平皿冷冻冻干。

　　1. 3. 2 3 型肺炎多糖和载体蛋白结合 取出冻干的多糖和蛋白后，用 0. 1 mol/L pH7. 0 的磷酸缓冲液溶解，然后加入 7 倍醛基含量的氰基硼氢化钠，在37 ℃ 下避光反应 48 h,反应结束后加入硼氢化钠避光封闭 5 h.

　　1. 3. 3 结合产物的纯化 封闭反应结束后，可以取出适量的样品跑胶（ SDS-PAGE） 初步观察多糖和蛋白的结合结果。然后通过疏水柱纯化去掉未反应的多糖片段，再用纯化水通过 100 K 膜包超滤 10 次以上去掉未反应结合的蛋白，得到最后的结合产物。超滤结束后，在超净台下用 0. 22 μm 囊式过滤器过滤，无菌储备。

　　1. 3. 4 多糖和蛋白的检测 采用蒽酮法检测多糖的含量，采用 Lowry 法检测蛋白含量。测得的多糖含量与蛋白含量的比值即为结合产物中多糖与蛋白的结合比。

　　1. 3. 5 氢氧化铝佐剂的配制 氢氧化铝目标浓度20. 32 ~ 24. 84 g / L.分别配制 400 ml 0. 658 mol / L氯化铝溶液和 1. 577 mol/L 氢氧化钠溶液，置于 65℃ 水浴锅中保温。加入 200 ml 纯化水至烧瓶中，搅拌。然后用双头蠕动泵将两种溶液泵入加水的烧瓶中，混匀，继续搅拌30 min.将氢氧化铝佐剂混悬液稀释 5 倍，混匀，常温下静置待完全分层后，用蠕动泵抽取上清液 1 L.用冰醋酸调 pH 至 6. 5,且相对稳定。最后 121℃灭菌 30 min,结束后拧紧瓶盖，室温或 2 ~8℃保存。

　　1. 3. 6 疫苗的配制 样品的缓冲液为生理盐水和5 mmol / L pH5. 8 琥珀酸（ 已经 121 ℃ ,30 min 高压灭菌） .每个实验组需准备 9 ml 样品，3 ml/瓶。其中多糖浓度为 5 μg/ml,pH5. 8,已经使用 0. 22 μm滤膜过滤无菌。

　　1. 4 疫苗接种
　　
　　1. 4. 1 免疫分组 BALB /c 小鼠在动物房饲养 2 ~3 d 后挑选检疫合格的小鼠 100 只，按照检疫期结束时动物体重均衡性原则分组。本实验共设 10 组，每组 10 只 BALB/c 小鼠，雌性，第十组为阴性对照组。

　　1. 4. 2 免疫流程 两周免疫一次，共免疫 3 次，三免前每只小鼠单独采集二免血，三免结束后采集全血（ 见表 1） .血样处理和测定： 取血后将血样立即放入含有肝素钠的 Eppendorf 管中，温和颠倒几次，水浴中暂存，2 h 内低温 4 ℃条件下 8 000 r/min 离心 6 min,分离血清，放置于-20℃ 保存，避免反复冻融。