3 型肺炎球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的合成(2)

　　1. 5 ELISA 法检测抗体
　　
　　1. 5. 1 包被 将 3 型肺炎球菌纯化多糖抗原用包被液稀释至 10 μg/ml,每孔加入 100 μl 包被酶标板，4 ℃过夜。

　　1. 5. 2 洗涤 弃去包被液，每孔加入洗涤液 200μl,静置洗涤 5 min 甩干，此过程重复 3 次，拍干。

　　1. 5. 3 封闭 每孔加入 200 μl 1% BSA 封闭 1 h,同 1. 5. 2 过程重复 3 次后拍干。

　　1. 5. 4 加样 在 96 孔酶标板上横向加入待测稀释好的血清，每孔 100 μl,进行倍比稀释，以 1% BSA作为空白对照，37 ℃孵育1 h,孵育结束后，同1. 5. 2洗涤 3 次，拍干。

　　1. 5. 5 加入酶标抗体 每孔加 100 μl 一定稀释度的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG 抗体，37 ℃孵育 1 h,孵育结束后，同 1. 5. 2 洗涤 6 次后拍干。

　　1. 5. 6 显色 加 TMB 显色液 100 μl,避光显色 10 ~15 min.

　　1. 5. 7 终止 每孔加终止液 2 mol /L 浓硫酸 50 μl终止反应。

　　1. 5. 8 检测 使用酶标仪在 450 nm 下测定吸光度。

　　2 结果

　　2. 1 高碘酸钠的消耗实验 在活化过程中，跟踪观察高碘酸钠随时间的消耗情况。图 1 是在 85 ℃多糖水解 0. 5、1. 0、1. 5 h 三个处理条件下在活化反应中高碘酸钠的消耗情况：图 1 中可以根据 OD280 得知 NaIO4的浓度。图 2 中我们可以发现，在初始情况下，水解 0. 5 h 多糖溶液中高碘酸钠 OD 值最低，水解1. 0 h 多糖溶液中 OD 值居中，水解 1. 5 h 多糖溶液中高碘酸钠 OD值最高，说明水解时间长的多糖消耗高碘酸钠的能力较弱。随着时间的进行，三条曲线逐渐降低，高碘酸钠逐渐被消耗，在 16 h 以后 OD 值基本不再发生变化。所以 23 ℃反应 19 h 是可行的。

　　2. 2 不同高碘酸钠浓度对多糖活化度的影响 从图3 我们可以看出，随着高碘酸钠浓度的增加，多糖活化表位产生的醛基数量在增加，多糖活化度在随之降低。选取合适的活化度成为活化过程关键所在。
　　
　　2. 3 不同多糖活化度的对比实验 从图 4 可以看出，活化过程中活化度对多糖的回收率没有很明显的差异。在结合过程中，活化度很小的时候，反应剧烈，发生交联，所以回收率处于 0 点，随着活化度的升高，回收率有升高的趋势。活化度增大，多糖活化的醛基位点就少，不利于蛋白的结合，所以在活化度10 以后有个很明显的下降趋势。所以我们初步选择活化度 10 为最优点。

　　2. 4 投料比对结合反应的影响 结合反应中，分别加入20∶10、10∶5、15∶5、20∶5、10 ∶2. 5 不同投料比的多糖和蛋白，观察初步结果，上样量为 10 μg 蛋白，如图5 所示： 胶图泳道上方即为结合产物。从胶图中可以看出投料比 20 ∶10 的初步结合情况最好，在 60 附近的条带较少，几乎没有游离蛋白，而 10 ∶5、15 ∶5、20 ∶5的游离蛋白相对较多，10 ∶2. 5 的结合产物相对较少，所以结合反应中初步选择 20 ∶10 投料比。
　　
　　2. 5 多糖不同水解条件对免疫原性的影响 在对多糖的预处理中，通过对水解时间和温度的筛选，使用高碘酸钠的氧化，之后与载体蛋白结合，配制成疫苗，考察制备条件对最终免疫原性的影响，免疫实验的结果如表 2 所示： 前四组为不同时间的水解处理，后四组为不同温度的水解处理。前四组可以看到随着在 85 ℃下时间的增加，结合比逐渐降低，但是在1 h 的免疫效价最高，达到 3. 93.选定水解处理时间 1 h 后，后四组研究不同温度的影响。随着温度的升高，结合比没有明显的变化趋势，免疫原性逐渐升高。85 ℃和 95 ℃免疫原性几乎没有差别。考虑到对多糖抗原原始分子结构的保护，我们选择85 ℃下水解处理 1 h 做为最优条件。

　　2. 6 活化度对免疫原性的影响 活化实验中，多糖浓度为2 g/L,考察多糖与蛋白结合比对最终免疫原性的影响，免疫的数据如表 3 所示： 可以看出随着活化度的减小，醛基数量的增加，结合比越来越小，结合的蛋白越来越多，并且效价呈现出上升的趋势。

　　免疫原性没有太大区别，都维持在 4 左右。考虑到多糖原始结构免疫原性，所以我们选择活化度为 10左右作为最优活化度。

　　3 讨论

　　肺炎荚膜多糖的血清型很多，根据多糖抗原免疫机制的需要、化学性质以及载体蛋白的不同，每种血清型都有适合自己的结合方法。结合疫苗的结合化学主要是指根据荚膜多糖和所选载体蛋白的性质，在保证多糖抗原的抗原决定簇（ 抗原表位、特异性基团） 不被破坏，免疫原性以及免疫反应性不受影响的基础上，选择合适的结合方式进行结合。实质就是通过一定的化学反应或借助连接剂将多糖抗原和载体蛋白连接在一起。多糖的修饰和活化程度，分子量的大小，特异性基团的多少，结合方式，与载体蛋白的结合比例，交联程度，结合产物分子量的大小，结合产物中游离多糖的含量等很多因素都会影响到结合疫苗的免疫原性。因此对工艺步骤的各个阶段进行质量监督是十分必要的。

　　随着结合疫苗价数和载体蛋白剂量的增加，结合物之间或共免疫抗原之间产生干扰的可能性就越大。解决这一问题需要对免疫干扰的机制进行更深入的研究，应用不同载体来结合荚膜多糖是一种可行的方法。肺炎球菌表面蛋白 A （ PspA） 广泛存在于 90 多种肺炎球菌的血清型中，在以 PspA 为载体应用于肺炎结合疫苗中，PspA 发挥载体作用的同时，还对肺炎球菌具有免疫保护。这样不仅可以增大血清型的覆盖率，同时也防止在大量的商业疫苗过度使用中由于相同蛋白而引发的免疫应答功能障碍。研究者还以沙门菌为载体，构建了传递多种 Pn蛋白抗原的沙门菌疫苗，并证实这种疫苗经口服免疫能诱导保护作用[7,14].

　　3 型肺炎链球菌在我国属于导致肺炎频率较高的病原体，所以针对地区选择高发血清型进行研究显得格外重要[15].目前市场肺炎球菌结合疫苗包含的血清型均是参照西方发达国家的流行病学资料，对于其他血清型没有相应的预防作用。地域和个体的不同，血清型的地理分布限制了疫苗发挥的最大作用。发展中国家在疫苗引进及开发过程中还需要进一步完善本地区的流行病学资料，使得所开发的疫苗最大限度的覆盖本地区优势发病血清型，同时密切关注疫苗可能导致肺炎球菌引起疾病的主要血清型发生明显转换，采取更合理的免疫预防策略，达到最佳免疫预防效果。

　　此外肺炎结合疫苗研究成本较高，使其在发展中国家的应用受到限制。发展中国家的肺炎感染占有很大的比重，要想起到全球预防的作用，降低成本，使其成为绝大多数人可以承担起的商品显得尤为重要，这样才能更好地预防肺炎球菌感染的传播。

　　本实验选用 CRM197 作为载体蛋白，通过在水解温度、水解时间、活化度以及投料比四个方面对 3型肺炎球菌多糖结合疫苗的探究优化，可以在幼小鼠体内表现出较高的免疫原性，为以后研究多价肺炎结合疫苗奠定了基础。

　　参考文献：

　　[1] 陆 权 . 儿童肺炎链球菌性疾病的治疗[J]. 世界临床药物，2012,32（ 12） : 705-708.
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　　[5] Lee CJ,Wang TR,Frasch CE. Immunogenicity in mice of pneumo-coccal glycoconjugate vaccines using pneumococcal protein carriers[J]. Vaccine,2001,19（ 23） : 3216-3225.