苦马豆素( SW) 属于吲哚里西啶生物碱,最早是从灰苦马豆中分离得到的[1].研究发现,SW 是棘豆属[2]、黄芪属[3]等疯草植物的主要有毒成分.疯草在新疆地区分布广泛,不利于该地区畜牧业的发展.
疯草属于豆科植物,除含有疯草毒素外,还含有丰富为,SW 相对分子质量小,为半抗原,需要将 SW 与大分子载体蛋白( 如 BSA) 耦联合成人工抗原( SW -BSA) ,然后用其免疫家畜,诱导产生特异性抗体,可使家畜获得免疫力并在采食疯草时得到保护.童德文等[8]用 SW - BSA 免疫莎能奶山羊,以甘肃棘豆作为攻毒饲草进行试验,结果取得一定保护效果.在国内研究中,还未见用免疫方法预防新疆本地家畜疯草中毒的研究报道.本试验用合成的人工抗原免疫新疆特有和田羊,通过检测血清特异性抗体水平和生化指标,分析 SW - BSA 对和田羊的免疫原性和安全性,以期为防治和田羊疯草中毒奠定基础.
1 材料.
1. 1 试验动物.
和田羊 12 只,年龄为 2 岁左右,体重为( 28. 0 ±1. 2) kg,购自和田地区策勒县.
1. 2 主要试剂.
SW - BSA,由新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室制备; 弗氏完全佐剂( FAC) 、弗氏不完全佐剂( FAI) ,购自 Sigma 公司; 谷草转氨酶( AST) 、谷丙转氨酶( ALT) 、乳酸脱氢酶( LDH) 、碱性磷酸酶( AKP) 、肌酐( CRE) 、α - 甘露糖苷酶( AMA) 检测试剂盒,均购自南京建成生物工程研究所; 其余常规试剂均为国产分析纯,试验用水为超纯水.
1. 3 主要仪器.
全波长酶标仪( 型号为 Power Wave XS) ,购自美国 Bio - tek 公司; 生化分析仪 ( 型号为 Vet Test8008) 、离心机( 型号为 Stat Spin VT) ,购自北京安普生化科技有限公司; 精密电子天平( 型号为 BS124) ,购自德国 SARTORIUS 公司; 超纯水系统( 型号为 Di-rect - Q3) ,购自美国 Millipore 公司; 高速冷冻离心机( 型号为 MR231) ,购自法国 Jouan 公司.
2 方法
2. 1 试验动物处理.
试验羊进入羊舍前,先用 84 消毒液对羊舍进行消毒,观察 7 d,驱除试验羊体表及体内寄生虫,将试验羊随机分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组,每组 4只.试验羊自由采食青干草,每只羊每日补饲精料300 g,分上午、下午 2 次饲喂,自由饮水.
2. 2 免疫试验.
参照参考文献[8]中的方法制备疫苗,使用 FAC对各试验组羊进行基础免疫,首免时用 FAC 和生理盐水的混合液( 体积比为 1∶1) 充分乳化 SW - BSA;第 1 次和第 2 次加强免疫时用 FAI 和生理盐水的混合液( 体积比为1∶1) 乳化 SW - BSA; 第3 次加强免疫时用生理盐水乳化 SW - BSA.试验组免疫剂量和次数见表 1.
2. 3 血清抗体效价的测定.
以首免为第0 天,在每次免疫前对试验羊空腹静脉采血,免疫结束后每隔 7 d 采血 1 次,共采血 10次.采用间接血凝试验( IHA) 和间接酶联免疫吸附试验( ELISA) 检测试验羊血清抗体效价的变化.IHA条件参照参考文献[8],红细胞用 30 μg/L 的 SW 致敏.ELISA 条件参照参考文献[9],测量样品孔OD450值( P) 与阴性对照孔 OD450值( N) ,以 P/N >2. 1判定样品为阳性.
2. 4 血清 E - 玫瑰花环试验.
参照参考文献[10]中的方法,计数 200 个淋巴细胞,凡 1 个淋巴细胞结合 3 个红细胞或以上者为 1个玫瑰花环阳性细胞,计算玫瑰花环形成率.
2. 5 血清生化指标测定.
参照相应检测试剂盒说明书测定血清中 AST、ALT、LDH、AKP、AMA、CRE 水平.
2. 6 体液中 SW 的定性检测.
2. 6. 1 尿液中 SW 的定性检测 在采血当日,对试验羊进行人工采尿.参照参考文献[11]中的方法分离结晶体,采用薄层层析法检查尿液中是否含有SW.吸附剂为硅胶 GF254,展开剂为氯仿∶ 甲醇∶ 氨水∶水( 70∶26∶2∶2) ,采用上行法展开.若在薄层板比移值( Rf) 为 0. 48 左右处出现紫红色斑点则判定为检测到 SW,否则判定检测液中不含 SW.
2. 6. 2 血液中 SW 的定性检测 取试验羊血清.
2 mL,加入纯化水 1 mL,丙酮 6 mL,超声处理10 min( 频率为 50 Hz,温度为 37 ℃) ,10 000 r/min 离心10 min后取上清液,重复上述步骤再处理沉淀物2 次,合并上清液,80 ℃ 水浴除去丙酮,最后冷冻干燥得到冻干物[12].该冻干物的检测方法同 2. 6. 1.
2. 7 统计学分析.
应用 SPSS 11. 5 软件中 One - Way ANOVA 方法对试验数据进行单因素方差分析及邓肯氏多重比较,检验误差为 5%和 1%.
3 结果与分析.
3. 1 血清抗体效价的检测结果.
所有试验羊均在第 2 次加强免疫后产生了抗SW 抗体,经 IHA 和 ELISA 检测,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组抗体效价均为22; 第3 次加强免疫后血清抗体效价明显升高,试验Ⅰ组和试验Ⅱ组最高抗体效价分别为26和 28; 试验组抗体效价均在第 3 次加强免疫后第14 天( 第 6 次采血) 达到最高值,并在第 3 次加强免疫后第 35 天时( 第 9 次采血) 仍保持在较高水平.2个试验组和田羊血清抗体变化趋势较一致,但试验Ⅱ组的抗体效价值始终高于试验Ⅰ组; 对照组未检测到抗 SW 抗体存在.结果见图 1.
3. 2 血清 E - 玫瑰花环试验结果整个免疫试验期内试验组和田羊血清 E - 玫瑰花环率呈上升趋势,并在第 6 次采血时达到最高值,然后试验组 E - 玫瑰花环率的变化趋势趋于平缓.
从第 3 次采血开始,试验Ⅱ组 E - 玫瑰花环率高于试验Ⅰ组,到第 9 次采血时 2 个试验组 E - 玫瑰花环率差异不显著.对照组 E - 玫瑰花环率波动较为平缓,但均小于试验组.结果见图 2.
3. 3 血清生化指标测定结果.
整个试验期内所有和田羊血清中 AST、ALT、LDH、AKP、AMA、CRE 水平均在正常范围内[13],且试验组与对照组之间差异不显著.结果见图 3、图 4、图 5.
3. 4 试验羊体液中 SW 的定性检测结果.
从第 1 次采血、采尿开始,到第 10 次时,试验组和田羊的尿液和血液中均未检测到有 SW.
4 讨论.
人工抗原免疫家畜能否产生抗体,不仅与人工抗原的质量和免疫动物个体状况有关,还与免疫程序有关.在一定范围内抗原剂量与免疫反应强度呈正相关,过低与过高都不利于抗体的产生.试验初期使用小剂量抗原免疫家畜,一方面考虑 SW 抗原决定簇较少,另一方面是因为小剂量可以激活高亲和力的淋巴细胞; 后期大剂量免疫则是考虑维持已经产生的抗体和进一步激活更多的淋巴细胞.与童德文等[8]的研究结果相比,本试验抗 SW 抗体效价的产生时间和周期较为一致,而加强免疫后的 28 d 内抗体效价高于童德文等人的报道,说明本试验免疫剂量和时间的设计是合理的.E - 玫瑰花环率的变化反映了动物机体免疫力的变化[10],其中主要受 T 淋巴细胞的影响.试验组前期 E - 玫瑰花环率上升,可能是因为人工抗原刺激动物机体免疫细胞表达,从而产生了大量高活性的 T淋巴细胞,导致 E - 玫瑰花环率的增加,说明该免疫反应可以有效阻止进入机体的 SW 侵害动物的免疫系统.试验中虽然检测到和田羊血清中出现抗 SW抗体,但该抗体能否保护和田羊在采食疯草时免于中毒,还有待于进一步研究证实.
SW 为半抗原,不具有完全的免疫原性,只有将其耦联到大分子载体上才能诱导出免疫原性[8].在研究 SW 人工抗原的免疫原性时,需要分析临床病理学指标,检测 SW 人工抗原免疫动物时对机体肝脏、肾脏功能的影响,探讨其对动物机体组织器官的影响,并监测尿液和血液中有无 SW 存在.AST、ALT、AKP 和 LDH 等酶主要分布于肝脏、心脏、骨骼肌等器官和组织,当脏器细胞的完整性遭到损害时,这些酶就逸入细胞外周的组织液,继而到达血液.因此,通过检测血液中这些酶的活性,可以在一定程度上反映器官细胞的受损状况[14],其中 AKP 是家畜疯草中毒后活性最早发生改变的,是极具有诊断意义的一种酶,AST 和 ALT 是肝脏受到损伤的参考依据,LDH 值的急速升高说明机体发生急性肝细胞、骨骼肌和心肌损伤.抗线粒体抗体在机体低聚糖代谢中起着重要作用,国内外研究结果表明,SW 对 AMA 具有强烈的和特异性的抑制作用[7].血肌酐是肌酸代谢终产物,血液中血肌酐含量的变化可反映肾脏排氮功能的变化,对于判定肾脏损伤程度具有重要意义.本试验中,和田羊在 50 d 的免疫试验和 42 d 的后续观察中均未发现血清酶指标发生特异性变化,尿液检测和血液检测均未发现机体中有 SW 单体,说明合成的SW - BSA 具有较好的免疫安全性.
综上所述,用 SW - BSA 免疫接种和田羊后可产生高效价的抗 SW 抗体,血清 AST、ALT、AKP、AMA、LDH 和 CRE 水平均在正常范围内,尿液和血液中未检测到 SW.说明 SW -BSA 可以在和田羊中安全应用.
参考文献:
[1] COLEGATE S M,DORLING P R,HUXTABLE C R. A spectro-scopic investigation of swainsonine: an α - mannosidase inhibitor i-solated from Swaisona canescens[J]. Aust J Chem,1979,32( 10) :
2257 - 2264.
[2] 李建科. 中国疯草研究现状与展望[J]. 中国农业科学,2003,36( 9) : 1091 -1099.
[3] 赵宝玉,童德文,葛鹏斌,等. 我国西部草原疯草危害调查[J].中国草地,2003,25( 4) : 11 -13.
[4] 王帅,胡建军,阿里木别克,等. 南疆地区小花棘豆的营养成分分析[J]. 草业科学,2010,27( 5) : 136 -139.
