百草枯致肺纤维化中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用(3)

　　3 讨 论。
　　
　　百草枯口服后以 PQ+的形式快速进入人体循环系统，使得肺、肾、肝和肾上腺、脑等多个器官出现损伤。进入体内的百草枯能够被肺泡上皮细胞所摄取，并于肺组织内蓄积，其浓度可达到血液浓度的10 ~ 90 倍，肺部是其主要的靶器官[9-10].尽管临床上采用依达拉奉注射液等抗氧化类药物和免疫抑制剂进行治疗，然而治疗效果差，治愈率较低，不能有效降低中毒患者的死亡率[11].因此探究百草枯致肺纤维化发生发展的分子机制具有重要意义。
　　
　　百草枯诱导肺上皮细胞、肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，导致细胞外基质沉积，使得肺泡壁增厚，肺泡结构紊乱，最终导致肺纤维化的发生发展[12].研究证实，肺上皮细胞经 EMT 转化而来的肌成纤维细胞占肌成纤维细胞总数的 50%左右，EMT 是肺纤维化发生发展的重要机制，肺上皮细胞EMT 的发生是肺纤维化形成的主要标志之一[13-15].本实验通过观察百草枯中毒大鼠病理切片，发现百草枯中毒能够导致大鼠肺组织损伤，引起肺水肿，导致肺泡壁增厚，促进胶原蛋白显着沉积，最终引起肺纤维化的发生发展。此外，体外实验采用 qRT-PCR技术检测发现，百草枯能够诱导 HBE 发生 EMT,由肺上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，逐渐失去上皮标记特性，E-cadherin 和 Occludin 表达水平显着降低，并逐渐表达肌成纤维细胞标记，α-SMA 和 Vimentin表达水平显着上升。结果证明肺上皮细胞发生EMT 进程是百草枯致肺纤维化发生发展的主要原因之一。因此，进一步研究百草枯导致肺上皮细胞EMT 发生的分子机制，进而阐明百草枯 致肺纤维化发生发展的分子机制至关重要。
　　
　　Wnt /β-catenin 信号通路广泛存在于各种组织中，是参与发育过程和病理生理过程的关键信号网络。Wnt 蛋白与膜上 Fzd（ Frizzled） 家族受体结合，使胞质内一系列蛋白活化，最终引起 Axin-GSK-3β-APC 降解复合体中的 GSK-3β 磷酸化，造成复合体解散，使得 Wnt/β-catenin 信号通路中的关键蛋白β-catenin 可以在胞质内大量积聚，随后 β-catenin 进入细胞核，结合转录因子 TCF,调控下游靶基因的表达，激活不同的下游信号途径，从而调控细胞的增殖、分化、迁移、极性产生等生理活动[16].针对百草枯导致肺纤维化的发生发展是否通过激活 Wnt/β-catenin信号通路从而诱导肺上皮细胞 EMT 发生，进而促进肺纤维化发生发展的问题本研究探讨了Wnt / β-catenin 信号通路在百草枯致肺纤维化发生发展中的可能作用，并寻求可能干预百草枯致肺纤维化发生发展的潜在靶点。
　　
　　本实验的 Western blot 检测发现，百草枯中毒后，与空白对照组大鼠肺组织相比，百草枯组大鼠肺组织内 β-catenin 表达水平显着升高，证明百草枯导致了 Wnt/β-catenin 信号通路的激活。激活的 Wnt/β-catenin 信号通路可能参与了百草枯诱导的肺上皮细胞 EMT 发生进程的调控，并在其中起了重要作用。体外实验采用免疫荧光、Western blot 和 qRT-PCR 技术检测抑制剂 DKK1 对百草枯诱导的 EMT进程的影响。检测结果发现，抑制剂 DKK1 能够抑制百草枯诱导的 Wnt/β-catenin 信号通路的激活，导致 β-catenin 表达水平显着降低，同时引起百草枯诱导的上皮标记 E-cadherin 和 Occludin 的表达水平回调，成纤维细胞标记 α-SMA 和 Vimentin 表达水平显着下调，证实 DKK1 能够通过阻断 Wnt/β-catenin 信号通路的激活抑制百草枯诱导的 HBE 上皮细胞EMT 发生。本实验证明了百草枯能够通过激活Wnt / β-catenin 信号通路促进 HBE 上皮细胞发生EMT,转分化为肌成纤维细胞，而 DKK1 能够通过阻断 Wnt/β-catenin 信号通路抑制百草枯诱导的 HBE上皮细胞 EMT 发生。
　　
　　然而，百草枯如何激活 Wnt/β-catenin 信号通路，哪些细胞因子或下游信号通路参与了百草枯的信号传递，尚有待进一步研究。本实验为进一步研究百草枯致肺纤维化发生发展的分子机制提供了理论依据和实验基础，为可能的临床治疗提供了潜在干预靶点。
　　
　　【参考文献】　　
　　[1] Rappold PM,Cui M,Chesser AS,et al.Paraquat neurotoxicity ismediated by the dopamine transporter and organic cation trans-porter-3[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2011,108（ 51） : 20766-20771.　　
　　[2] Neves FF,Sousa RB,Pazin-Filho A,et al. Nogueira-Barbosa,Severe paraquat poisoning: clinical and radiological findings in asurvivor[J]. J Bras Pneumol,2010,36（ 4） : 513-516.　　
　　[3] Choi Y,Cho K,Yoon S,et al. A case of paraquat intoxicationcaused by intravenous injection[J]. Am J Emerg Med,2008,26（ 7） : 3-4.　　
　　[4] Yang Z,Sun L,Nie H,et al. Connective tissue growth factor in-duces tubular epithelial to mesenchymal transition through the ac-tivation of canonical Wnt signaling in vitro[J]. Ren Fail,2015,37（ 1） : 129-135.　　
　　[5] Chen Y,Nie YC,Luo YL,et al.Protective effects of naringin a-gainst paraquat-induced acute lung injury and pulmonary fibrosisin mice[J]. Food Chem Toxicol,2013,58（ 4） : 133-140.　　
　　[6] Sun Z,Gong X,Zhu H,et al. Inhibition of Wnt/beta-cateninsignaling promotes engraftment of mesenchymal stem cells to re-pair lung injury[J]. J Cell Physiol,2014,229（ 2） : 213-224.　　
　　[7] Sun Z,Wang C,Shi C,et al. Activated Wnt signaling inducesmyofibroblast differentiation of mesenchymal stem cells,contribu-ting to pulmonary fibrosis[J]. Int J Mol Med,2014,33 （ 5） :1097-1109.　　
　　[8] Akhmetshina A,Palumbo K,Dees C,et al. Activation of canon-ical Wnt signalling is required for TGF - beta-mediated fibrosis[J]. Nat Commun,2012,3: 735.　　
　　[9] Zerin T,Kim YS,Hong SY. Protective effect of methylpred-nisolone on paraquat-induced A549 cell cytotoxicity via inductionof efflux transporter,P-glycoprotein expression[J]. Toxicol Lett,2012,208（ 2） : 101-107.　　
　　[10] Tsai HL,Chang JW,Yang HW. Amelioration of paraquat-in-duced pulmonary injury by mesenchymal stem cells[J]. CellTransplant,2013,22（ 9） : 1667-1681.　　
　　[11] 支巧明，孙海晨，钱晓明，等。 依达拉奉对百草枯中毒大鼠肺损伤的保护作用[J]. 医学研究生学报，2010,23（ 10） : 1033-1037.　　
　　[12] Dinisoliveira RJ,Pinho PGD,Santos L,et al. Postmortem analy-ses unveil the poor efficacy of decontamination,anti-inflammatoryand immunosuppressive therapies in paraquat human intoxications[J]. PLoS One,2009,4（ 9） : 954-958.　　
　　[13] Brown AC,Fiore VF,Sulchek TA,et al.Physical and chemicalmicroenvironmental cues orthogonally control the degree and dura-tion of fibrosis - associated epithelial-to-mesenchymal transitions[J]. J Pathol,2013,229（ 1） : 25-35.　　
　　[14] HanYY,Shen P,Chang WX.Involvement of epithelial-to-mesen-chymal transition and associated transforming growth factor-beta /Smad signaling in paraquat-induced pulmonary fibrosis[J]. MolMed Rep,2015,12（ 6） : 7979-7984.　　
　　[15] Xie L,Zhou D,Xiong J.Paraquat induce pulmonary epithelial-mesenchymal transition through transforming growth factor-beta1-dependent mechanism[J]. Exp Toxicol Pathol,2016,68 （ 1） :69-76.　　
　　[16] Van Scoyk M,Randall J,Sergew A. Wnt signaling pathway andlung disease[J]. Transl Res,2008,151（ 4） : 175-180.