百草枯致肺纤维化中Wnt/β-catenin信号通路的调控作用

　　[摘要] 目的 百草枯能够导致肺纤维化发生发展，但其发生机制尚不明确。文中探讨 Wnt/β-catenin 信号通路在百草枯致肺纤维化发生发展中的作用。 方法 SD 雄性大鼠 48 只，随机数字表法分为对照组和百草枯中毒组，每组 24 只。百草枯中毒组大鼠腹腔注射百草枯 30mg/kg 建立肺纤维化模型，对照组腹腔注射等量等渗盐水。于百草枯中毒后 14 d 和 28 d 断颈处死各组大鼠，剪取肺组织，HE 染色和马松染色检测肺纤维化程度，Western blot 检测 Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白β-catenin的表达水平。培养人肺上皮细胞，实验分为 3 组，空白对照组： 不作任何处理； 百草枯组： 给予 50 μmol/L 的百草枯处理 3d; 抑制剂组： 给予 50μmol/L 的百草枯处理，同时给予 Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂 DKK-1 20ng/mL 处理 3d.采用免疫荧光和 Western blot 检测 Wnt/β-catenin 信号通路关键蛋白 β-catenin 的表达水平，qRT-PCR 检测肺上皮细胞标记 E-Cadherin、Occludin 和成纤维细胞标记蛋白 α-SMA、Vimentin 表达水平。 结果 大鼠百草枯中毒后，HE 染色和马松染色结果显示，肺泡壁增厚，肺泡结构紊乱，胶原蛋白沉积，肺纤维化发生； Western blot 检测结果表明，与对照组大鼠相比，百草枯中毒组大鼠中毒 14d β-catenin 的表达水平显着升高[（ 0.38±0.04） vs （ 0.67±0.06） ,P<0.01],中毒 28 d 时高达（ 1.05±0.08） ,升高更为明显（ P<0.01） .与空白对照组相比，百草枯组 E-Cadherin、Occludin 表达水平显着下降（ P<0.01） ,成纤维细胞标记 α-SMA、Vimentin表达水平显着升高（ P<0.01） ; 而百草枯组相比，抑制剂组 α-SMA 和 Vimentin 表达水平显着下降，E-cadherin 和 Occludin 的表达水平显着上升（ P<0.01） . 结论 百草枯染毒导致大鼠肺纤维化发生，并导致肺组织 Wnt/β-catenin 信号通路激活，而阻断 Wnt/β-catenin 信号通路能够抑制百草枯诱导的上皮-间质发生，证实 Wnt/β-catenin 信号通路在百草枯致肺纤维化发生发展中起着重要的调控作用。
　　
　　[关键词] 百草枯； 肺纤维化； Wnt/β-catenin 信号通路； 上皮-间质转化。
　　
　　0 引 言。
　　
　　百草枯目前仍是世界范围内广泛使用的有机杂环类除草剂。在我国，口服百草枯致死率可达60.0% ~87.5%[1-2].百草枯中毒的主要的靶器官是肺，其特征性改变是肺损伤，早期表现为肺泡上皮细胞受损，炎症浸润，晚期则出现肺泡和肺间质的纤维化，患者最终死于呼吸衰竭[3-4].百草枯能够导致肺组织内大量炎性因子和细胞因子表达，激活相关信号通路，从而导致肺纤维化的发生发展[5].有研究表明： Wnt/β-catenin 信号通路在肺纤维化的发生发展过程中起着重要的调控作用； 高度激活的 Wnt/β-catenin 信号通路能够促进肺成纤维细胞、肺上皮细胞、干细胞转分化为肌成纤维细胞 （ Myofibro-blasts） ,促进胶原蛋白沉积，从而导致肺纤维化的发生发展[6-8].Wnt/β-catenin 信号通路在百草枯导致的肺纤维化发生发展中的作用并未见详细报道，本实验探讨 Wnt/β-catenin 信号通路在百草枯致肺纤维化中的调控作用。
　　
　　1 材料与方法。
　　
　　1.1 实验材料 人肺上皮细胞（ 16HBE） 购自中国科学院上海细胞库。百草枯试剂（ 美国 Sigma 公司） ,重组 DKK1 细胞因子（ 美国 PeproTech 公司） ,β-catenin 和 β-actin 抗体（ 英国 Abcam 公司） ,荧光二抗 Alexa Fluor 488（ 美国 Life Technologies 公司） .qRT-PCR 试剂盒（ 加拿大 Fermentas 公司） .
　　
　　1.2 实验动物分组 健康清洁级 SD 大鼠 48 只，体重 180~220 g,由我院比较医学科提供，实验动物合格证号： CXK（ 军） 2007-2012.按标准饮食喂养，饲养温度（ 21±2） ℃，湿度 40% ~ 70%,每日光照和黑暗各 12h.随机数字表法分为 2 组： 百草枯中毒组： 一次性腹腔注射百草枯溶液 20 mg/kg; 对照组：一次性腹腔注射给予与百草枯中毒组等量的等渗盐水，各 24 只。于百草枯中毒第 14 天和 28 天后处死各组大鼠，剪取肺组织，进行相关后续实验。
　　
　　1.3 肺组织 HE 染色及马松染色 各组大鼠肺组织剪取右下肺叶，4%多聚甲醛固定 16 h,经梯度脱水，石蜡包埋，做成 4 μm 厚度的切片，按照操作说明，切片进行 HE 染色和马松染色，在 100 倍光镜下观察肺组织结构和胶原蛋白沉积情况。
　　
　　1.4 人肺上皮细胞 HBE 的培养 无菌条件下 10%FBS 的 DMEM 高糖培养基（ 加入 1% L-谷氨酰胺，1%青链霉素） 培养 HBE 细胞，以 1×106个/mL 的密度接种于 100 mm 的细胞培养皿中，置于 37 ℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中，恒温培养，每 3 天换液 1 次，直至细胞生长至 80%融合。0.25%胰酶-EDTA 消化细胞，以 1 ∶ 3 的比例传代。
　　
　　1.5 Western blot 法检测 Wnt /β-catenin 信号通路关键蛋白 β-catenin 的表达情况 百草枯中毒组大鼠肺组织剪取左下肺叶，加入组织 RIPA 裂解液，研磨匀浆后，离心提取上清，Bradford 检测蛋白浓度，加入 loading buffer 溶液，存于-80 ℃。培养的 HBE细胞分为 3 组，空白对照组： 不作任何处理； 百草枯组： 给予 50 μmol/L 的百草枯处理 3 天； 抑制剂组：给予 50 μmol/L 的百草枯处理，同时给予 Wnt/β-catenin 信号通路抑制剂 DKK-1 20 ng / mL 处理 3 d.提取各组细胞蛋白，Western blot 检测 β-catenin 蛋白表达情况。每个样本取等量蛋白进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，电压 100 V,100 min,电泳后，进行转膜，电压20V,时间 10min.转膜后，PBS 清洗 3×5min.取出膜，放于封闭液（ 含3% 脱脂奶粉和 0.3% BSA）中，37 ℃ 封闭 2 h.PBST（ 含 0. 05% Tween 20 的PBS） 清洗 1 次，每次 5 min,将膜按照分子量裁成小条，加 入 多 克 隆 兔 抗 β-catenin 和 β-actin 抗 体（ 1 ∶3000） ,4 ℃ 孵育过夜后用适量 PBST 清洗6×5min.将膜又分别浸入 1 ∶ 10 000 的带 HRP 标记的羊抗兔二抗，室温孵育 1 h 后用适量 PBST 清洗6×5min.ECL 显色。Fluor Chem FC2 成像系统采集图像，Image J 软件进行灰度值分析。
　　
　　1.6 免疫荧光技术检测 HBE 上皮细胞 β-catenin蛋白的表达情况 将空白对照组、百草枯组、抑制剂组细胞在预冷的 4%多聚甲醛中固定 10min,PBS 清洗 2 次。0.1% Triton-X 100 进行 10 min 的穿孔处理，PBS 清洗 2 次。加入 3% BSA 37℃封闭 1h.一抗（ β-catenin） 4 ℃ 孵育过夜。PBS 清洗 3 次，羊抗兔 Alexa Fluor 488 的二抗（ 1 ∶200） 37 ℃ 孵育 1 h.PBS 清洗 6 次，细胞核用 DAPI （ 5 μg / mL） 常温下孵育 6min,PBS 清洗 6 次。90%甘油封固，激光共聚焦显微镜下拍照。
　　
　　1.7 qRT-PCR 技术检测 HBE 上皮细胞标记 E-Cadherin、Occludin 和成纤维细胞标记 α-SMA、Vim-entin 基因表达水平 采用 TRIZOL 提取法提取空白对照组、百草枯组、抑制剂组细胞 RNA,进行逆转录后，RT-PCR 试剂盒逆转录得到 cDNA.取 1 μL 逆转录得到的 cDNA 进行 qRT-PCR 实验，检测 E-Cadher-in、Occludin、α-SMA 和 Vimentin 基因的表达水平。选择 18sRNA 为内参基因，目的基因引物序列来自基因数据库，引物序列为 18sRNA 正向： CTCCATCTTG-GCATCGCTGT; 反 向： GCTGTCGCCTTTACAGTTCC;E-Cadherin 正 向： GCGCTCCCCTCAGATGGTGTC; 反向： ACGATGGCCGGCTTGTTGC; Occludin 正向： GCT-CAGGGAATATCCACCTATCA; 反 向： CACAAAGTTT-TAACTTCCCAGACG; α-SMA 正向： GCATCCGACCTT-GCTAACG; 反 向： TCTCCAGAGTCCAGCACAATAC-CAG; Vimentin 正 向： ACATCCACCCGCACCTAC; 反向： CAACTCCCTCATCTCCTCCTC.均由上海生工生物工程有限公司合成。融解曲线鉴定产物特异性，每个样品重复测定 3 次。反应体系如下： 2×AB Mix5 μL,10 μmol / L 上下游引物各 0.25 μL,cDNA 1 μL,水 3.5μL.扩增条件为 95℃预变性 10 min,95 ℃变性 15s,60℃退火延伸 60s,共40 个循环。将对照组mRNA 水平设为 1.
　　
　　1.8 统计学分析 采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析。定量资料用均数±标准差（ x±s） 表示，多组均数比较用单因素方差分析，两两组间比较采用 SNK 检验。以 P≤0.05 为差异有统计学意义。