肾脏是淀粉样变性常见的受累器官， 约占肾活检的1.25%,多发生于年龄在 50 岁以上的老年人群中。淀粉样变性肾病是指淀粉纤维大量沉积于肾脏引起的病变 , 随着我国人口老龄化的进程不断加快 , 其发病率也呈逐年上升的趋势[1].而关于淀粉样变性肾病的诊断率一直较低 , 确诊率低 , 更需要探寻更佳的病理技术进行诊断。本文主要探讨淀粉样变性肾病的染色方法及体会 , 旨在提高病理技术 , 报告如下。
1 资料与方法
1. 1一般资料
选取本院 2012 年 3 月~ 2014 年 12 月收治的淀粉样变性肾病患者的活检标本共 15 例作为本次实验的实验标本。
1. 2方法
1. 2. 1对 15 例标本进行常规染色及特殊染色。①标本的常规处理。首先使用 10% 福尔马林进行固定 , 并给予梯度酒精脱水 , 每个步骤进行 30 min, 使用二甲苯透明 10 min×2, 给予60℃浸蜡后进行石蜡包埋。切片厚度为 5 μm, 并置于 45℃水浴展开 , 干燥时间为 20 min.脱蜡至水。②染色配置分别为 :HE、储备液、碱性工作液、碱性刚果红工作液、酸性高锰酸钾溶液、5% 草酸溶液。③碱性刚果红染色方法 :使用 mayer 氏苏木素液进行内染色 10 min 后蒸馏水洗 , 给予盐酸乙醇分化再用蒸馏水洗 , 随后放入到碱性工作液内进行染色 20 min, 再放入碱性刚果红工作液内 20 min, 进行无水乙醇三次脱水 , 二甲苯透明后固封。④酸性高锰酸钾氧化刚果红染色。
1. 2. 2免疫组织化学染色。首先对标本进行常规处理 , 包括对标本进行固定、以石蜡包埋、冰冻切片、脱蜡至水、抗原修复并 TBS 洗 5 min×3.再利用 3% 双氧水阻断内源性过氧化物酶 , TBS 洗 5 min×3.其次 , 进行抗体颜色 , 使用抗鼠抗人淀粉样蛋白 A、兔抗人轻链蛋白 κ、兔抗人清点蛋白 λ，孵育 1 h ;TBS 洗 5 min×3 ;滴入 EnVision, TBS 洗 5 min 后加色源底物 DAB.使用蒸馏水漂洗 , 进行苏木素的对比颜色 ,封片 , 观察。标本使用偏振光显微镜观察和透视电镜观察。
2 结果
2. 115 例淀粉样变性肾病患者的标本通过 HE 切片可以观察到特殊蛋白沉淀 , 出现肾小球的局部阶段性均质粉染 , 且无结构 ;部分标本小动脉壁也有特殊蛋白的沉淀。通过 PAS染色显示为红色 ;Masson 染色为 9 例浅绿色、6 例粉色 ;PASM 套染 Masson 染色为灰绿。碱性刚果红染色出现 15 例阳性 , 光镜下观察有肾小球系膜区域和毛细血管壁 , 小动脉有砖红色团块 , 使用偏振光镜检查为苹果绿。使用酸性高锰酸钾氧化处理后标本仍均为阳性。
2. 2免疫组化染色中 , AA 染色均为阴性 , κ 染色显示 14例为阴性 , λ 染色显示 14 例为阳性。电镜下观察有纤维状结构且排列紊乱。κ 染色、λ 染色阳性表现为小动脉壁、毛细血管壁和 （ 或 ） 肾小球系膜区有团块沉淀 , 直径为 9 nm左右 , 且无分支。
3 讨论
淀粉样变性主要可以分为两种 , 即局灶性和系统性淀粉样变性 , 系统性淀粉样变性主要包括血清淀粉样物质、免疫球蛋白轻链、衰老性、家族性的淀粉样变性以及透析性的淀粉样变性 ;局灶性淀粉样变性主要包括快速性进展相关的疾病 （ 克雅病等 ）、帕金斯病以及局灶的免疫球蛋白轻链淀粉样变性。
近年来 , 随着免疫和分子生物学的进展 , 临床上对淀粉样变性肾病已有较为清晰的认识 , 关于淀粉样蛋白的检验技术日趋先进[2].而对淀粉样病变的生化研究也分离出 17 种 ,其中以轻链蛋白最为常见 , 其次为淀粉样蛋白 A.HE 染色是光镜检查肾标本中必备的染色方法之一 , 能充分显示肾小管上皮细胞的损伤和炎细胞浸润程度 , 还能显示肾小球的细胞增生情况[3].PAS 染色不仅具有 HE 染色的功能 , 同时还能很好的显示基底膜 , 辨别内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞 , 可使检测者了解基底膜增生情况和毛细血管塌陷情况。PASM 染色能清晰的观察到肾小球各种细胞及免疫复合物的成分和沉积情况 , 并能帮助判别膜性肾病、淀粉样肾病、膜增生性肾小球肾炎[4].Masson 染色较为繁琐 , 但染色效果较好 , 可区分肾间质水肿和肾间质纤维化 , 显示肾小球内沉积或聚集的 IC 或其他血浆蛋白成分。刚果红主要是观察肾淀粉样变性肾病 , 染色方法简单[5, 6].在以往的临床研究中 , 免疫组化法一直较多被用于诊断AA 型 , 并取得较好的效果 , 但在诊断 AL 型时可能会发生轻链断裂的现象 , 导致部分抗原决定簇缺失 , 对抗体无任何反应 , 出现误诊。因此 , 在检测时可应用多种抗体进行免疫组化染色 , 将轻链蛋白、淀粉样蛋白 A 联合使用 , 使得诊断更为准确。
而在病理染色的过程中本研究认为 , 碱性刚果红染色出15 例阳性 , 且没有过多的分化步骤 , 不会因为过度分化导致染色结果受到影响 , 因此更为可靠 , 加之使用偏振光显微镜使用 , 可信度较高。但免疫组化染色使用透视电镜观察 , 可以更好地发现淀粉样纤维 , 对刚果红染色不明显的标本可以做补充观察。
综上所述 , 对淀粉样变性肾病需采用多种染色方法结合效果较好 , 使用碱性刚果红染色较为便利 , 使用免疫组化染色后透视光镜观察有助于发现早期不典型病变。
参 考 文 献
[1] 张燕 , 陈剑 , 刘海静 , 等 . 石蜡切片免疫荧光法在肾病穿刺组织中的应用 . 北京大学学报 （ 医学版 ）， 2011, 43（6）：900-902.
[2] 李敏 , 姚梅宏 , 曾玲 , 等 . PASM-Masson 染色法在肾穿刺活检特殊染色中的应用与体会 . 临床与实验病理学杂志 , 2014,30（6）：693-694.
[3] 吕增华 , 张杨杨 , 朱玉红 , 等 . 肾穿刺活检六胺银染色套染 Masson 染色方法的改良 . 临床与实验病理学杂志 , 2012,28（11）：1289-1290.
[4] 郭海旺 . HE 染色和双酶染色观察大鼠肾的脉管构筑特点 . 中国美容医学 , 2012, 21（z2）：47-48.
[5] 豆文宪 , 骆新兰 , 朱小兰 , 等 . 肾穿刺活检标本切片厚度对PAS 染色效果的影响 . 诊断病理学杂志 , 2015, 22（2）：125.
[6] 黄燕凤 , 苏菁 , 王海萍 , 等 . 六胺银加马松三色双重染色在肾穿刺活检组织中的应用 . 中国基层医药 , 2012, 19（14）：2183-2184.
