百草枯(paraquat,PQ),又名克芜踪,是全世界目前使用广泛的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂,对人畜具有较强毒性,可经皮肤、呼吸道和消化道等3种途径进入体内,产生多系统毒性。我国作为农业大国,百草枯中毒患者呈现不断上升趋势,临床死亡率高达60%~80%,目前对于百草枯中毒仍缺乏特异性的治疗。硫辛酸(Lipoic Acid,LA)1951年由Reel首次从猪肝中分离出来,是参与三羧酸循环过程中不可缺少的物质,硫辛酸在脂溶性及水溶性环境下都可以溶解,其脂溶性可使它在减少细胞膜上的自由基,如清除脂质过氧化物;其水溶性则使它能够与细胞液接触,有效地清除源于线粒体的自由基。
LA能抑制NF-КB活化,减少炎症细胞释放IL-1β、TNF-α;此外,LA可抑制脂多糖诱导的动脉内皮细胞,心内膜内皮细胞Fractal kine的表达及CX3CR1阳性细胞对活体内血管、心肌的浸润,改善心肌功能紊乱。本研究旨在通过观察LA对百草枯中毒后细胞因子水平的变化,来探讨LA对百草枯中毒的心肌损伤的可能保护机制。
1、材料与方法
1.1实验动物
购买健康雄性Sprage-Dawley大鼠126只,由湖北医药学院实验动物中心提供,体质量200±20g。将SD大鼠随机分为正常对照组(NS)、百草枯中毒组(PQ)、百草枯+还原型谷胱甘肽组(GSH)、百草枯+硫辛酸治疗组(LA)。NS组6只,PQ组和GSH组各24只;LA组72只,再细分为3个亚组,即30mg/kg、60mg/kg、100mg/kg亚组,每亚组24只。
1.2实验试剂
百草枯(商品名:克无踪,20%水剂)。硫辛酸注射液:药品规格:20ml:0.6g×2支。还原型谷胱甘肽注射液:药品规格:0.6g(粉剂)。
NF-κB、NOS、NO、CK、CKMB、LDH、AST试剂盒,购置于武汉新启迪生物科技有限公司(进口分装)。
1.3模型制备及给药方法
NS组给予等量的生理盐水灌胃;PQ组给予PQ50mg/kg一次性灌胃染毒;GSH组给予PQ50mg/kg一次性灌胃,半小时后给予GSH200mg/kg腹腔注射给药,GSH组造模后每天同一时间再重复给药一次;LA组在给予PQ50mg/kg一次性灌胃,半小时后分亚组给予LA30mg/kg、60mg/kg、100mg/kg腹腔注射给药,LA组造模后每天同一时间再重复给药一次。
NS组取材就指定在注射生理盐水造模后第7d取材,PQ组、GSH组和LA组取材是在模型成功后的1、3、5、7d。所有大鼠在氯胺酮麻醉下解剖,沿胸骨中线切开暴露胸腔,腹主动脉取血,结扎心脏血管,将心脏取出。
1.4样本收集及观察指标
将心肌标本沿纵轴一分为二,左半部分以10%中性福尔马林溶液固定,送病理科石蜡包埋、切片及HE染色,普通光镜下观察其病理变化。右半部分以冰冷生理盐水清洗后,置于-80℃冰箱中保存以备后续的NF-κB、NOS、NO水平测定。血清-用干净试管收集血液,室温凝固2h,离心1000g×10min,收集血清,分装后-80℃冷冻保存。
ELISA法检测AST、LDH、CK、CK-MB水平,严格按照试剂和说明书操作。
心肌组织匀浆上清的制备:采集心肌组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。用移液管量取0.1MPBS,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块。机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间20秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行)。将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000r/min离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。
取上清。分装-80℃冻存备用。ELISA法检测心肌组织内NOS、NO、NF-κB水平,严格按照试剂和说明书操作。
1.5统计学方法
采用SPSS17.0统计软件对结果进行方差(ANOVA)分析、LSD-t检验和SNK-q检验,组间和组内数据采用方差齐性检验后,进行LSD-t检验和SNK-q检验比较,所有数据用珚x±s表示,以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。
2、结果
心肌组织病理检查(见表1)。NS组心肌组织结构完整,未见出血、水肿、坏死。而LA组在进行干预后的组织学出现上述改变较PQ组少,心肌组织损伤较PQ组及GSH组轻。
2.1NF-κB水平,NOS、NO活力NF-κB水平,NOS、NO活力见表2~4。
2.2心肌酶谱水平。用ELISA法测出腹主动脉血中心肌酶谱的水平,得出数据我们看出LA组相同时点均比PQ组及GSH组低,P<0.01有显著性差异;LA组各亚组各时点都比NS组高,P<0.05有统计学意义;LA组各亚组各时点间比较,P<0.05有统计学意义。见表5~8。
3、讨论
百草枯自身引起的氧化还原反应,一方面由于超氧阴离子的生成,从而导致更多的具有高反应的细胞大分子有毒的活性氧类的形成,NADPH、还原型谷胱甘肽等的氧化引起还原当量的减少,由此导致生化过程中正常细胞功能所必需的NADPH的需求遭到破坏;另一方面百草枯诱导iNOS产生一氧化氮,它与来源于百草枯氧化还原循环的超氧化物起反应,形成了强有力的氧化剂过氧硝酸盐,造成严重的细胞损伤。在百草枯中毒的早期阶段NF-kappaB可以被激活,活性NF-kappaB会诱发IL-6、IL-8炎症因素的合成,然后诱导的炎症反应,在百草枯中毒的早期阶段炎性反应参与了组织损伤。大剂量百草枯中毒者可在短期内出现多脏器功能障碍,多器官功能损害伴微循环障碍,是百草枯中毒患者早期死亡的主要原因。
PQ在肌肉组织存留时间较长,平均半衰期84h,因此对肌肉组织丰富的器官可能会造成持续性损害,其对人体毒性反应主要的靶器官之一就是心肌组织。PQ对于心肌的损伤与血中百草枯浓度成正相关,主要引起心肌水肿、充血、出血。在正常人肺上皮细胞培养实验研究中,百草枯组iNOS的表达水平和亚硝酸盐形成是显著增加的。Zocrato等也研究发现,百草枯中毒增加可诱导性一氧化氮合酶表达。由此可见百草枯中毒可导致NOS表达增加,从而使NO水平升高,在PQ的强氧化环境下,生成过氧硝酸盐引起细胞和组织损伤,进而引起器官功能障碍。
PQ诱导iNOS介导的一氧化氮的产生,从而增强髓过氧化物酶活性和脂质过氧化,从而引起氧化应激。过多的超氧化物和一氧化氮很容易彼此反应形成过氧硝酸盐,PQ导致细胞严重的氧化、硝化应激,氧化应激和硝化应激引起心肌细胞坏死(通过脂质过氧化反应、蛋白质氧化、DNA损伤导致能量危机),NF-κB可诱导氧化、硝化应激反应和炎症反应在组织中扩散。
PQ本身产生活性氧和过氧硝酸盐可诱导细胞内核转录因子(NF-κB),NF-κB可激活许多促炎因子(iNOS,IL-1β,TNF-a)使炎症反应扩大,进一步加重心肌损伤及心肌细胞代谢异常,导致心力衰竭而死亡。
本实验数据显示:PQ组的NF-κB、NOS及NO水平明显高于NS组、GSH组及LA各组,差异有统计学意义;PQ组的心肌酶谱水平明显高于NS组、GSH组及LA各组,差异有统计学意义。心肌病理切片亦显示心肌组织淤血、出血,心肌细胞变性较其他各组严重,提示PQ引起的心肌组织氧化损伤及炎症反应严重。
GSH组心肌组织中NF-κB、NOS、NO水平明显低于PQ组,心肌酶谱亦出现相似变化,两组比较有统计学意义;随着干预时间的延长,GSH第7天组NF-κB、NOS、NO及心肌酶谱水平显著低于第一天组,两组比较有统计学意义。提示GSH可以减轻心肌组织的氧化损伤和炎症损伤,使心肌酶谱明显降低,心肌病理切片显示心肌细胞损伤明显轻于PQ组;持续的补充GSH,可以改善氧化及炎症损伤。
硫辛酸作为一种抗氧化剂可以直接清除活性氧、再生内源性抗氧化剂,如谷胱甘肽、维生素E和C,并具备金属螯合作用。DHLA与活性氧(ROS)相互作用是主要的形式,但硫辛酸的氧化形式也能使自由基失去活性。硫辛酸通常作为丙酮酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶的辅酶。硫辛酸和二氢硫辛酸产生一个强有力的氧化还原电子对,标准氧化还原电位为0.32V,而还原型谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物(GSH/GSSG)的氧化还原电位为0.24v,因此,硫辛酸/二氢硫辛酸常被称为“万能抗氧化剂”。硫辛酸抑制TNF-a诱导IκB抑制剂的降解,并抑制主动脉上皮细胞NF-κB表达的活化。硫辛酸可以引起糖尿病患者单核细胞的NF-κB下调。硫辛酸强有力的抑制人类T细胞和破骨细胞前体细胞的NF-κB活化,并抑制肾小管上皮细胞及主动脉细胞NF-κB易位进细胞核。由于硫辛酸的多途径抗氧化及抗炎作用,将其应用于PQ中毒所致心肌损伤的治疗,实验证明效果显著。
大鼠心肌组织NF-κB水平、NOS活力及NO水平:LA组相同时点均比PQ组及GSH组低;LA亚组各时点都比NS组高;LA亚组各时点间比较也有显著差异。提示PQ可引起明显的组织氧化损伤,GSH可以减轻PQ引起的组织氧化损伤,相比之下,LA可显著减轻PQ引起的组织氧化损伤,且随着LA剂量的增加,效果更加显著。
通过心肌组织的苏木精-伊红染色也可以看出,PQ组较LA组及GSH组心肌损伤加重,心肌组织淤血出血,心肌细胞变性严重,说明了LA及GSH有效的减轻心肌组织的病理损伤。LA各亚组与GSH组比较,LA各亚组的心肌损伤较轻,仅表现为局部嗜酸性变及心肌细胞水肿,随着LA剂量的增加,心肌病变越轻,100mg组心肌组织基本正常;而GSH组则表现为明显的心肌细胞变性。LA组与GSH组的病理表现说明,LA具有多途径的抗氧化及抗炎症反应作用。总之,硫辛酸在治疗百草枯中毒所致心肌损伤的机制中,与其抗氧化作用以及抑制了炎症因子的超表达有关,它可能是通过调控NF-κB、NOS、NO的水平,进而使氧自由基及炎症因子产生减少,从而产生保护心肌细胞的作用。
参考文献：
[1]万丽萍,熊向阳.α-硫辛酸与核因子-κB信号通路[J].江西医药,2009,44(10):1039-1042.
