第二章 褐鳟日本品系和亚东鲑遗传多样性分析及起源探讨
褐鳟是鲑科鱼类中重要的商业鱼类之一，国内仅在西藏亚东地区有分布，称为亚东鲑（与褐鳟属同物异名），因该鱼体色鲜艳美丽，故当地称之为“花点鱼”,肉质鲜美，无肌间刺，深受当地群众喜爱，是西藏重要的经济鱼类资源[10].近年来，由于自然捕捞强度过大，造成野生种群数量日趋下降。因此，深入开展遗传学方面的研究对保护亚东鲑资源具有重要意义。
线粒体 DNA（mtDNA）因其突变率较高，而且复制过程中产生的突变比较容易固定，几乎不发生重组，已成为研究物种起源、群体演化、遗传结构等的重要标记[72].近年来，微卫星（Microsatellite） 分子标记因具有重复性高、容易检测、呈共显性遗传等优点[73,74],被广泛应用于种群遗传多样性研究、遗传图谱的构建、品系鉴定和群体进化研究[75-78]等研究领域。有关亚东鲑的研究中很少有涉及到遗传方面。本文利用线粒体 DNA 测序和微卫星技术探讨日本品系褐鳟和亚东鲑两个种群的遗传多样性以及物种起源，以期为该物种的资源保护与合理开发利用提供遗传学方面的理论依据。
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
样品为黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼类试验站人工养殖的褐鳟日本品系和西藏农牧科学院蔬菜研究所水产养殖课题组提供的亚东鲑，从两个群体中分别随机抽取 94 尾和 49 尾个体，每尾均剪取少量鳍条。鳍条采集后放入离心管中用 75%酒精保存。
2.1.2 基因组 DNA 提取和检测
2.1.2.1 DNA 的提取
1.剪下 25-50mg 组织鳍条，用蒸馏水把酒精冲洗干净，并用滤纸吸干水分，剪碎鳍条放入离心管中，加入 180?l Genomic Digestion Buffer 和 20μL Proteinase K ,充分混匀震荡，放置于 55℃恒温水浴锅中进行水浴消化至澄清（1-4h），偶尔颠倒混匀。
2.室温 12000rpm 离心 3min,吸取上清液到新的离心管中。
3.加入 20μL RNaseA,颠倒混匀，室温放置 2min.
4.加 Genomic Lysis/Binding Buffer 200μL,颠倒混匀。
5.加入无水乙醇 200μL,颠倒混匀。
6.将溶解产物（~600μL）转移到 Spin Column 中，10000rpm 离心 1min,移除收集管，置于一个干净的收集管中。
7.加 500μL Wash Buffer 1,室温 10000rpm 离心 1min,将 Spin 柱置于一个干净的1.5ml 离心管中，加入 500μLWash Buffer 2,12000rpm 室温离心 3min8.将Spin柱置于一个干净的1.5毫升离心管中，加入50μL Elustion Buffer,12000rpm离心 2min,将提取的 DNA 放入 4℃或-20℃条件下保存。
2.1.2.2 DNA 的检测
用胶浓度为 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度，用紫外分光光度法测其浓度，然后稀释成合适的浓度进行 PCR 扩增。
2.1.3 D-loop 基因片段扩增及测定
用于扩增线粒体 D-loop 基因片段的引物分别为 LN20 （5'-ACC ACT AGC ACCCAA AGC TA-3‘） 和 HN20 （5'-GTG TTA TGC TTT AGT TAA GC-3’）[79],由上海英潍捷基贸易有限公司合成。PCR 反应体系 25 μl,各个组分浓度分别是：0.2 mMdNTP 2.5 μl,10×PCR buffer 2.5 μl,2 mM MgCl21.5 μl,1.0 U TaqPolymerase 0.2 μl,10 mM 上下游引物各 1 μl,50 ng 模板 DNA1 μl,剩余体积用无菌水补足。PCR 反应条件：95℃预变性 3 min;95℃变性 30 s;最适退火温度退火 30 s;72℃延伸 60s;26~28 个循环；最后 72℃总延伸 5 min,产物放于 4℃条件下保存。
采用琼脂糖凝胶（胶浓度 1%）电泳检测 PCR 产物，然后用凝胶成像仪进行成像分析。挑选扩增结果较好的 PCR 产物送往上海英潍捷基贸易有限公司进行双向测序。
2.1.4 微卫星分析方法
2.1.4.1 引物来源和 PCR 扩增
查阅相关文献[80 -83]获得合适的微卫星引物，由上海英潍捷基贸易有限公司合成，引物序列及引物的退火温度见表 2-1.PCR 反应体系 15 μl,各个组分浓度分别是：0.2 mM dNTP 1.5 μl,10×PCR buffer 1.5 μl,2 mM MgCl21.2 μl,1.0 UTaqPolymerase 0.18 μl,10 mM 上下游引物各 0.5 μl,50 ng 模板 DNA1 μl,剩余体积用无菌水补足。PCR 反应条件：95℃预变性 3 min;95℃变性 30 s;最适退火温度退火 30 s;72℃延伸 60 s;26~28 个循环；最后 72℃总延伸 5 min,产物放于 4℃保存。
2.1.4.2 电泳分离及染色
PCR 产物先采用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后用 10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶恒电压下电泳分离，电泳缓冲液为 1×TBE.电泳结束后，用 0.1%的硝酸银染色，扫描仪记录结果。根据电泳图谱以及 PCR 产物长度利用相关软件分析并判定基因型。
2.1.5 数据分析处理
2.1.5.1 褐鳟和亚东鲑 mtDNAD-loop 分析
利用 SeqMan 软件对测序成功序列进行拼接，并从 GenBank 中查找并下载欧洲五个居群的褐鳟 D-loop 基因的部分单倍型序列（表 2-2），与本研究中测定的17 个日本品系褐鳟和 19 个亚东鲑线粒体控制区基因序列一起分析。利用 Clustal W软件对已知序列和 GenBank 中下载的 D-loop 序列进行对位排列，对齐后删除两端冗余序列，一致序列进行保留，使用 MEGA5 软件进行系统发育分析，利用邻近法（neighbor-joining method, NJ） 构建系统发生树，以大西洋鲑作为外群，并利用bootstrap test 检验所得聚类结果的可靠性。
2.1.5.2 日本品系褐鳟和亚东鲑微卫星分析
利用 POPGENE 3.2 软件分别计算观测等位基因数（A）、有效等位基因数（ Ae）、等位基因频率、观测杂合度（Ho） 、期望杂合度（He）、Nei 氏遗传距离和遗传相似系数等参数。利用 Software Cervus 3.0 软件计算群体的多态性信息含量（PIC）。
2.2 结果与分析
2.2.1 线粒体 D-loop 基因扩增结果
试验选取线粒体引物对D-loop基因进行PCR扩增，获得日本品系褐鳟和亚东鲑群体的D-loop基因片段产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，部分电泳图谱如图2-1.
2.2.2 线粒体 D-loop 基因测序结果
样品成功测序后，生物公司提供每个样品的序列和图谱。测序结果的质量可通过图谱结果反映，使用Chromas 2.3软件读取图谱文件，选择杂峰少且主峰清晰的序列作为质量好的结果进行分析，部分结果如图2-2.
2.2.3 基于 D-loop 基因序列构建的分子系统树
本研究中测定的日本品系褐鳟和亚东鲑线粒体控制区基因序列和其已经描述的欧洲褐鳟D-loop基因序列一起分析，利用MEGA 5软件的邻近法构建分子系统树（图2-3），其中J表示日本品系褐鳟，Y表示亚东鲑。从图中可以看出，本试验中日本品系褐鳟和亚东鲑与欧洲大西洋居群的褐鳟聚在一起，亲缘关系最近。由分子系统树可见本研究中日本品系褐鳟有6个单倍型，亚东鲑有4个单倍型。
2.2.4 微卫星 PCR 扩增结果与等位基因
试验选取 8 个微卫星标记对日本品系褐鳟和亚东群体进行扩增，所有标记均扩增出了具有特异性的清晰条带。图 2-4 为位点 Ssa197 、Strutta58、 Str85INRA和 T3–13 的部分电泳结果。8 个微卫星位点及等位基因频率统计见表 2-3.由表 2-3可见， 在两个群体中共检测出 62 个等位基因， 日本品系褐鳟和亚东鲑的等位基因数都为 47 个， 但等位基因的大小及分布在 2 个群体间存在很大的差异。两者共有的等位基因数为 32 个， 占等位基因总数的 51.61%.
2.2.5 种群的遗传多样性
两个群体的遗传变异参数如表 2-4.由表 2-4 可见，日本品系褐鳟的等位基因数为2~10个，亚东鲑群体为4~9个，平均有效等位基因数分别为3.1304和3.8988;观测杂合度范围分别为 0.3404~0.7128 和 0.1020~0.8776,其中日本品系褐鳟群体的平均观测杂合度为0.5612,亚东群体为0.5510,期望杂合度分别为0.4671~0.7794和 0.5216~0.7932;日本品系褐鳟群体中多态信息含量（PIC）为 0.3680~0.7440,平均为 0.5964,其中有 2 个中度多态标记（0.25≤PIC≤0.5），6 个高度多态标记（PIC≥0.5），而亚东群体的 PIC 为 0.466~0.837,平均为 0.5926,其中有 1 个中度多态标记（0.25≤PIC≤0.5），7 个高度多态标记（PIC≥0.5）。哈迪-温伯格平衡检验结果表明日本品系褐鳟群体有 4 个位点偏离平衡（P<0.05），亚东群体有 7 个位点偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.05）。
2.2.6 种群间的亲缘关系
基于等位基因频率， 计算两个群体间的遗传相似系数和遗传距离。该研究中 2个群体间的遗传相似系数为 0.6436,遗传距离为 0.4407.F-statistics 分析结果为 2个群体的 Fst 为 0.0098~0.2131,平均为 0.0778.
2.3 讨论
2.3.1 线粒体 D-loop 序列分析
褐鳟作为欧洲的土着种，在当地存在很多野生种群，种群遗传学研究已经确定了五个主要的居群：大西洋、地中海、亚得里亚海、多瑙河以及一个褐鳟亚种marmoratus[84].Bernatchez[85]探讨了这五个已知居群可能的起源。他表明所有现存的多瑙河居群的原始祖先来自黑海及相关支流。他还做出假设亚得里亚海最有可能起源于巴尔干半岛或安那托利亚。最近一项关于地中海鳟鱼历史生物地理学的研究也提供了更多的证据来支持上述观点。线粒体 DNA D-loop 基因是线粒体基因组中进化最快的区域，具有较高的突变率从而形成多态性。亚东鲑是 19 世纪由英国人从欧洲引种放流到亚东河中，经过漫长的适应过程，在无人为干涉的情况下，西藏地区的亚东鲑已经能够在自然环境中繁殖生长并维持稳定的种群数量。本研究中测得的褐鳟日本品系和亚东鲑线粒体 D-loop 序列与大西洋居群聚到一起，遗传距离最小，亲缘关系最近，可以推测这两个群体有相似的起源，可能来源于欧洲的大西洋居群。
2.3.2 日本品系褐鳟和亚东群体的种群遗传多样性
遗传多样性作为评价物种种质资源状况的一个重要依据，它是适应环境和进化的遗传基础。通常情况下，一个群体具有丰富的遗传多样性，说明该物种具有较强的生存适应能力，相反，遗传多样性降低其对环境的适应性也就会降低最终导致物种退化[86].在微卫星标记中，反映群体遗传多样性的重要指标包括有效等位基因数（Ne）、杂合度（Ho）和多态信息含量（PIC）等，其值越高，表明该群体的遗传多样性也就越丰富。
遗传杂合度能够反映群体在各个位点的遗传变异程度，普遍认为它是度量群体遗传变异的一个理想参数[87].De Woody 等[88]通过统计 78 种淡水和海水鱼类 524个微卫星位点指数变化范围的数据显示淡水鱼类的平均杂合度和等位基因数分别为 0.45±0.25 和 9.1±6.1.本研究中，日本品系褐鳟和亚东鲑的平均期望杂合度分别为 0.6517 和 0.7171,有效等位基因数分别为 3.1304 和 3.8988.和淡水鱼统计数据相比，杂合度处于高等水平，有效等位基因处于中等水平，可见，2 个群体的生物遗传多样性均处于中上等水平。
多态信息含量（PIC）也是衡量位点多样性的一个重要指标，它是等位基因频率和等位基因数之间的函数关系，反映了基因的变异程度。一般 PIC<0.25 说明该位点为低度多态性，0.25<PIC<0.5 群体中该位点表现为中度多态性，当 PIC>0.5 时，表现为高度多态性[89].该研究中，日本品系褐鳟 8 个微卫星位点有 2 个中度多态标记（0.25≤PIC≤0.5），其余 6 个全为高度多态位点（PIC≥0.5），而亚东群体有 1 个中度多态标记（0.25≤PIC≤0.5），7 个高度多态标记（PIC≥0.5）。日本品系褐鳟群体的平均多态信息含量为 0.5964,亚东鲑群体为 0.5926,说明这 2 个群体的遗传多样性较高。
2.3.3 Hardy-Weinberg 平衡的偏离
Hardy-Weinberg 平衡检测可以用来分析群体的遗传结构。当一个群体处于哈迪-温伯格平衡时，每个等位基因的分布频率相对稳定，即观测杂合度和期望杂合度差异不显着[90].本研究中，检测结果表明 8 个微卫星位点中日本品系褐鳟群体和亚东群体分别有 50%和 87.5%位点偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.05）。目前产生这种现象确切原因还不清楚，可能是由于鲑科冷水鱼类种群数量的上下波动，近年来由于人为捕捞或水域生存环境的局限，亚东鲑数量急剧减少，还有其它原因比如群体内近交，基因突变，迁移等都会导致群体偏离哈代-温伯格平衡。
2.3.4 亲缘关系分析
遗传相似系数和 Nei 氏遗传距离是衡量群体间亲缘关系远近和遗传变异程度的两个重要指标。遗传相似性指数越高，遗传距离越小，表示群体间亲缘关系越近，遗传变异程度越低[91].Thorp 等[92]研究分析认为：不同物种间遗传相似系数I=0.2-0.8,相同科属群体间 I=0.1-0.5,同种群体间 I=0.8-0.97.本研究中两个群体的遗传相似系数为 0.6436,此数值低于同种群体间高于同科属群体间数值范围。
遗传分化指数（ Fst） 可以衡量群体间的遗传分化程度。当 Fst > 0. 25 表明群体间分化很大，0.15 < Fst < 0.25 表明群体间存在较大分化，0.05 < Fst< 0.15 为中度分化，0 <Fst < 0.05 表明群体的分化较弱[93].该研究结果表明，2 个群体的 Fst 平均为0.0778,表明 2 个群体间有一定的分化，即 7.78%为群体间遗传变异，而群体内的遗传变异为 92.22%,说明日本品系褐鳟和亚东鲑群体间变异水平较低，大部分变异来自于群体内。本研究通过对褐鳟和亚东群体的遗传相似系数和遗传分化指数分析表明这两个群体存在中等程度分化。
2.4 结论
经线粒体 D-loop 序列比对分析，发现这两个群体有相似的起源，可能引种于欧洲的大西洋居群。本研究通过对日本品系褐鳟和亚东群体的杂合度和多态信息含量进行分析，发现这两个群体具有较高的遗传多样性。哈迪-温伯格平衡检验表明 2 个群体的基因型分布均处于不平衡状态，经遗传相似系数、遗传距离和遗传分化指数分析分析可知，2 个群体表现出中等程度遗传分化。
