密码子优化提升毕赤酵母中AiiA蛋白的表达(2)

　　根据密码子优化设计原则，对aii A基因进行密码子优化，成功设计获得可翻译成同义氨基酸序列的密码子优化基因Oaii A（ 图1）。优化后的序列整体的AT含量降低，GC含量由38. 0%增加到45. 1%,更有利于在毕赤酵母中的表达。
　　
　　2. 2 Oaii A多拷贝表达载体的构建及验证
　　
　　将 提 取 的 亚 克 隆 质 粒p UC57-Oaii A、p PICZαB用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，将含有相同粘性末端的Oaii A基因和p PICZαB表达载体连接后导入E. coli DH5α感受态细胞中，提取转化子质粒，经PCR（ 图2（A） ）、双酶切验证（ 图2（B） ） ,成功获得p PICZαB-Oaii A.以该单拷贝载体为基础，利用Bgl Ⅱ和Bam H Ⅰ这对同尾酶构建含二拷贝和三拷贝Oaii A基 因 的 表 达 载 体p PICZαB-2Oaii A和p PICZαB-3Oaii A,构建过程如图3所示。对构建的二拷贝和三拷贝表达载体用Bam H Ⅰ单酶切进行鉴定（ 图4中1 ~ 4泳道）。在构建二拷贝和三拷贝表达载体时，表达盒的连接方向可以是与载体上已有的表达盒同向或反向。应用Bgl Ⅱ和Bam H Ⅰ双酶切对表达盒方向进行鉴定，鉴定结果表明所获得的二拷贝和三拷贝表达载体中表达盒的方向是一致的（ 图4中5 ~ 7泳道）。
　　
　　2. 3多拷贝工程菌GS115-p PICZαB-x Oaii A筛选
　　
　　将上述3种表达载体通过电转化毕赤酵母GS115,涂布于含有100 μg·m L- 1Zeocin抗生素的YPD平板中，30 ℃培养3 d后挑取单克隆，提取基因组，用酵母通用引物5'AOX引物与Oaii A特异性下游引物进行PCR鉴定，结果表明目的基因已成功整合至毕赤酵母基因组中，获得重组毕赤酵母GS115-p PICZαB-x Oaii A（ 图5）。
　　
　　2. 4 GS115-p PICZαB-x Oaii A表达及鉴定
　　
　　将验证正确的GS115-p PICZαB-x Oaii A进行表型鉴定后，挑取Mut+型重组转化子利用甲醇进行诱导表达，72 h后收集发酵上清，用镍柱亲和层析法对表达产物进行浓缩纯化，将表达产物分别进行SDS-PAGE电泳 （ 图6（A） ） 及Western Blot（ 图6（B） ） 验证，成功实现重组质粒GS115-p PICZαB-x Oaii A分泌表达Aii A蛋白。
　　
　　2. 5 ELISA比较毕赤酵母工程菌Aii A表达量
　　
　　前期研究表明A410值与Aii A蛋白浓度呈正相关，利用建立的ELISA方法对诱导表达发酵上清进行测定，比较不同工程菌表达Aii A的差异。由图7（A） 所示，ELISA测定Aii A蛋白的标准曲线为y= 0. 566 1x + 0. 135 0,R2= 0. 991 7,具有良好的线性关系。对密码子优化前后工程菌进行诱导表达72 h后，取发酵液上清进行ELISA测定 （ 图7（B） ） ,密码子优化后的GS115-p PICZαB-x Oaii A的Ai-i A表达量较优化前的p PICZαB-aii A具有很大的提高，表达量从p PICZαB-aii A的1. 38 mg·L- 1分别提高至2. 64,2. 84,2. 93 mg·L- 1（ 图7（B） ） ,表达水平分别提高了91. 3% 、106. 8%和112. 3%,但是从单拷贝至三拷贝工程菌表达Aii A的水平并没有成倍数增加 （ 图7（B） ）。
　　
　　2. 6 GS115-p PICZαB-x Oaii A表达产物的抗病性检测
　　
　　表达产物抗病性检测表明胡萝卜软腐欧文氏杆菌可引起马铃薯产生严重的腐烂现象，经过分离纯化的Aii A蛋白可在一定程度上抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌对马铃薯的致腐烂作用，工程菌GS115-p PICZαB-x Oaii A随着aii A基因拷贝数的增加，其抑制腐烂程度有一定的增强趋势 （ 图8）。
　　
　　3讨论
　　
　　国内外研究显示，密码子优化及提高外源基因拷贝数对于其在异源宿主中的表达水平具有一定的积极作用。在提高目的基因于毕赤酵母中的拷贝数方面，研究人员提出了多种路线方法，其中主要分为细胞外构建重组多拷贝表达载体后转化毕赤酵母从而构建多拷贝重组毕赤酵母，以及通过基因剂量效应筛选多拷贝重组毕赤酵母。前者在构建重组表达载体时根据载体的不同特点，从构建单拷贝重组工程菌开始，在载体上进行基因的重复叠加，这一方案的实施虽然较为繁琐，却能相对准确地获得目标拷贝数的重组工程菌； 后者则利用抗性基因剂量与宿主抗抗生素的能力成一定正相关的原理对较高拷贝的重组毕赤酵母进行筛选。
　　
　　基于前期研究中Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达量较低[14],本研究对aii A基因进行密码子优化，且为了更准确地获得含有特定拷贝数基因的毕赤酵母，基于人工构建的含有多拷贝Oaii A基因的表达载体，选择便于表达载体以单位点插入整合到毕赤酵母基因组的位点进行线性化后转化毕赤酵母，通过Mut+筛选，构建了多拷贝重组毕赤酵母GS115-p PICZαB-x Oaii A,并成功进行了Aii A蛋白的分泌表达，表达产物Aii A对胡萝卜欧文氏软腐菌引起的马铃薯软腐病具有较好的抑制作用。本研究发现密码子优化后GS115-p PICZαB-x Oaii A的Aii A表达量较优化前p PICZαB-aii A具有很大的提高，从单拷贝到二拷贝和三拷贝，表达水平分别提高了91. 3% 、106. 8%和112. 3%,表明密码子优化可以有效提高Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达； 但本研究同时发现多拷贝表达载体从单拷贝至三拷贝工程菌表达Aii A的水平并没有成倍数增加，且其表达产物的增加不显着，可能是因为虽然拷贝数增加了，但是宿主中的tRNA、核苷酸以及氨基酸等转录和翻译的原料不能及时供给，从而导致其蛋白表达受到限制[20].此外，前期研究也发现基因拷贝数和毕赤酵母重组工程菌的蛋白表达量之间没有线性关系，主要是由于受到蛋白质的分泌效率、蛋白质的折叠，以及启动子的影响，由于蛋白质的折叠以及分泌效率的制约，导致细胞内质网中堆积了大量的不可溶蛋白，而不同的启动子对多基因的调节具有不同的效应，这些都是影响多拷贝载体高效表达重组蛋白的一个重要原因[22].作者的研究提示未来在探索Aii A蛋白在毕赤酵母中的高表达时，进行密码子的优化可以有效提高产量，今后可以进一步对密码子进行优化，以期更大地提高Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达。但是如果想通过增加拷贝数来提高产量必须充分考虑多拷贝重组工程菌中异源蛋白的折叠和分泌效率，以及选择高效的适合多拷贝表达的基因启动子。此外，本文在研究GS115-p PICZαB-x Oaii A表达产物在抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌对马铃薯的致腐烂作用时发现拷贝数增加能够在一定程度上增强工程菌对欧文氏菌引起腐烂的抑制效果。其主要原因可能并非拷贝数增强而引起Aii A蛋白的活力增强，而是因为拷贝数增加在一定程度上提高了Aii A蛋白的表达量，使得用于抑制胡萝卜软腐欧文氏杆菌的Aii A浓度升高，从而增强了其抑制效果。
　　
　　虽然本研究发现了通过密码子优化能够显着提高Aii A蛋白在毕赤酵母中的表达，但是其离生产实践还有很大的距离，因此今后在进一步通过密码子优化提高Aii A表达的同时，应该进一步寻找能够更大程度上提高其产量的方法，同时也可以通过对Aii A蛋白进行点突变以提高Aii A蛋白的酶活，以促进Aii A蛋白的产业化生产和在农业上的应用。
　　
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