鸡肺表面活性蛋白A（chicken pulmonarysur-factant protein A,cSP-A）是Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌的一种亲水性糖蛋白，属于C型凝集素家族中的一种[1].C型凝集素的共同特征在于：氨基（N）末端含有胶原样结构域（collagen-like region,CLR）、羧基（C）端含有碳水化合物识别结构域，可与病原体和过敏原 结 合[2].cSP-A基 因 位 于 鸡6号 染 色 体上，编码区全长669bp,含222个氨基酸残基（aa），分为5个结构域：N端区、CLR、未知区、茎区（neckdomain）和凝集素糖识别区（carbohydrate recogni-tion domain,CRD）[3].近年来，对SP-A蛋 白的免疫学功能的研究越来越深入，哺乳动物源SP-A已被证实可结合多种病原体，增强肺泡巨噬细胞的趋化作用和吞噬功能，诱导免疫细胞增殖，并刺激促炎细胞因子的产生[4].
虽然不同动物源的SP-A在功能上高度相似，但通过氨基酸序列比对却发现：cSP-A与哺乳动物源SP-A的同源性仅有40%左右[5],cSP-A在鸡体内的组织分布和临床作用是否与哺乳动物源的SP-A一致尚不得而知[1],而且，从鸡肺泡灌洗液获取天然cSP-A蛋白的步骤较为繁琐，费用昂贵，阻碍了cSP-A的临床研究和应用。
本实验室的前期工作已经对cSP-A的N末端和CRD分别进行了原核表达和多克隆抗体制备[6],但没有涉及cSP-A全长基因的研究。本研究将 选择pCold-TF载体进行cSP-A全基因的载体构建，以期在大肠杆菌中实现高效可溶性表达，并对纯化产物进行生物学活性检测，为进一步研究cSP-A的功能和临床作用奠定基础。
1材料与方法
1.1实验动物与试剂
60日龄健康三黄鸡1只购自安徽省某 鸡 场。pMD19-T Simple、pCold-TF原核表 达 载 体 均 购 自宝生物工程（大连）有限公司。大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感 受 态、TRIzol试 剂 均 购 自 美 国In-vitrogen公司。反转录试剂盒购自普洛麦格生物技术有限 公 司。Phanta Max Super-FidelityDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物公司。T4DNA连接酶、限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ均购自英国NEB公司。DL2000DNA ladder、凝胶回收试剂盒均购 自德国Qiagen公司。质粒小量提取纯化试剂盒购自美国Axygen公司。His·Tag融合蛋白纯化试剂盒购自德国Merck公司。10~250ku预染小分子质量蛋白质Marker购 自 美 国 热 电 公 司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自美国Sigma公司。ECL显色发光试剂盒购自美国Piece公司。cSP-A的凝集素糖识别区多克隆抗体由本实验室制备[6].纯化的天然cSP-A蛋白由本实验室制备[6-7].
1.2 RT-PCR
取健康鸡肺组织100mg,加入TRIzol试剂提取组织mRNA,-80 ℃保存备用。参照GenBank中cSP-A登录的全长序列（AF411083）设计了1对引物，上游 引 物：CCCAAGCAACCATGTTGTCT-TATT,下 游 引 物：CTAATATTCACAGACTGT-GAGGCGG.利用Oligo d（T）18引 物 对 鸡 肺 组 织mRNA进 行 反 转 录 并 获 得 其cDNA,然 后 进 行PCR,扩增程序：95℃ 5min;94℃ 30s,60℃ 50s,72℃ 1min,共30个循环；72℃ 10min;维持在10℃。PCR产 物 进 行 电 泳 鉴 定，回 收 目 的 条 带，与pMD19-T Simple载 体 连 接，连 接 产 物 转 化DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素（Amp）的LB平板，过夜培养，挑取阳性菌落进行PCR鉴定，并送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
1.3 cSP-A成熟肽基因的PCR扩增
在获得cSP-A全长序列的基础之上，设计1对引物 用 于 扩 增cSP-A成 熟 肽 全 长，上 游 引 物 为cSPA-55F:ATTCATATGCCATGCACAGAAC（下划线处为NdeⅠ酶切位点），下游引物为cSPA-R:ATAGTCGACCTAATATTCACAG（下 划 线 处 为SalⅠ酶切位点）。PCR反应条件：94 ℃ 2min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 1min,30个循环；72℃ 10min;10 ℃维持。PCR产物进行电泳 鉴定，回收目的条带，-20℃储存备用。
1.4重组表达载体的构建
利用限制性内切酶NdeⅠ+SalⅠ分别对目的基因的PCR产物和pCold-TF表达载体质粒DNA进行双酶切，将纯化回收的PCR产物与相应酶切的表达载体连接，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞。PCR筛选阳性克隆，提取质粒DNA,送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
1.5重组蛋白的诱导表达、纯化
将pCold-TF与pCold-cSPA均 转 化 到BL21（DE3）感受态细胞中，37℃培养过夜。取少量利用不同浓度的IPTG进行诱导表达，16℃诱导24h后收集菌液，超声波裂解，5000r/min离心10min,分别收取裂解上清和包涵体沉淀。利用His·Tag融合蛋白纯化试剂盒纯化。分别取上述少量蛋白质样品，加入 等体积2×上样缓 冲液，95 ℃加 热处 理5min,同时将pCold-TF空载体菌诱导产物作为阴性对照。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析融合蛋白的表达情况。
1.6免疫印迹
分别取0.1、0.5和1μg的cSP-A纯化产物，加入等量的2×上样缓冲液，95℃加热处理5min后，经SDS-PAGE分离，利用垂直转印仪，将胶上蛋白质转移至硝酸纤 维素膜（NC）上，经考马斯 亮蓝染色，将NC膜转移到50g/L脱脂奶粉溶液中4℃封闭过夜。弃封闭液，TBST洗 涤后，加1∶1 000稀释的cSPA-CRD小鼠多克隆抗体，室温下反应2h,TBST洗涤3~5次，二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG,室温作用1h,TBST洗涤3~5次，用化学发光试剂盒（ECL）进行显色，在天能发光成像系统中成像分析。
1.7鸡肺灌洗液的制备及天然SP-A蛋白的制备与纯化
选取1.5kg左右的健康三黄鸡，按150mg/kg体质量注射戊巴比妥进行麻醉，对鸡颈部皮肤进行剥离，用手术刀做1cm纵切口，将连有医用三通阀的灌洗装置插入鸡气管内，一次性注入15mL灭菌PBS溶液，反复灌洗，收集洗液，经1 000r/min离心10min,收集上清即为肺部灌洗液。采用Maltose-agarose亲和层析法[7]提取并纯化鸡肺灌洗液中的SP-A蛋白。
1.8抑菌活性检测
采用单层琼脂平板扩散法进行检测，以纯化的天然cSP-A蛋白作为对照。分别取巴氏杆菌、大肠杆 菌（CMCC44102）、甲 型 副 伤 寒 沙 门 菌（ATCC9150）、金 黄 色 葡 萄 球 菌（ATCC25923）、粪肠球菌（CMCC29212）于LB培养基平板划线，37℃过夜培养。活化后的指示菌按1∶100滴加到40℃左右灭活的LB培养液中，振荡混匀，倒入灭菌的平板中，冷却凝固后，用内径7mm的打孔器分别在各指示菌平板上均匀打孔，依次加入1μg纯化的天然cSP-A蛋白、1μgpCold-cSPA原核表达纯化蛋白、1μgpCold-cSPA诱导表达产物、50μL无菌水（阴性对照）、50μL卡那霉素（100μg/mL）（阳性对照）。
2结果
