大肠杆菌中鸡SP-A蛋白的表达及其生物学活性(2)

　　2.1 RT-PCR及克隆鉴定
　　
　　通过RT-PCR成功地从鸡肺组织mRNA中扩增出预期大小的目的条带。将该PCR产物连接入pMD19-T载 体 中，阳 性 克 隆 被 命 名 为pMDT-cSPA.测序结果发现，该基因为cSP-A,与GenBank中登 录 的 序 列（登 录 号：AF411083）的 同 源 性 为100%.为便于在大肠杆菌中表达，剪去其信号肽部分，以pMDT-cSPA质 粒 为 模 板，以cSPA-55F和cSPA-R为上、下游引物扩增出cSP-A成熟肽基因，双酶切PCR产物，再克隆 入 原 核 表 达 载 体pCold-TF中。经PCR鉴定和测序，结果成功构建了表达cSP-A成熟肽基因片段的原核表达载体，遂将其命名为pCold-cSPA（见图1）。
　　
　　2.2重组蛋白的表达和纯化
　　
　　在16 ℃培 养 条 件 下，分 别 经 终 浓 度 为0.1、0.2、0.5和1mmol/L IPTG诱 导pCold-cSPA 24h,SDS-PAGE鉴 定 发 现：用 终 浓 度 为1 mmol/LIPTG诱导菌，pCold-cSPA的表达量 相 对 较 大，表达产物大 小 约 为80ku（见 图2A）。随 后，利 用1mmol/L IPTG大量诱导阳性克隆菌200mL,经超声波裂解后，融合蛋白主要以上清形 式存在（见图2B）。取表达上清加入到平衡好的His·Tag树脂中，表达上清与树脂悬液的比例约为5∶1;最后分段收集洗脱液，取少量进行SDS-PAGE检测，结果成功获得纯化的cSP-A融合蛋白（见图3）。
　　
　　2.3 Western-blot分析
　　
　　用抗cSPA-CRD小鼠多克隆抗体血清对纯化后的cSP-A蛋白进行Western-blot检测。结果显示，在80ku处出现单一的特异性条带（见图4），表明诱导表达的cSP-A重组蛋白能被抗其多克隆抗体特异性识别。
　　
　　2.4抑菌活性检测
　　
　　采 用 单 层 琼 脂 平 板 扩 散 法 检 测 原 核 表 达 的cSP-A蛋白对各个指示菌的抑菌情 况，结 果（见 图5）显示，阳性对照（即天然cSP-A蛋白和卡那霉素）对巴氏杆菌、大肠杆菌（CMCC44102）、甲型副伤寒沙门菌（ATCC9150）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、粪肠球菌（CMCC29212）均有一定的抑菌活性，但原核表达的cSP-A蛋白没有明显的抑菌活性。
　　
　　3讨论
　　
　　与哺乳动物源SP-A比较，发现cSP-A有下列4点不同。第一，CLR区不完整，仅包括一个胶原样G-X-Y三联体重复序列，有趣的是，同样定位于鸡6号染 色 体 上 的 鸡 肺 凝 集 素（chicken lunglectin,cLL）在基因结构上无CLR区[8],但重组cLL蛋白能抑制人H3N2和H1N1亚型流感病毒的血凝活第11期黄琪等：鸡肺表面活性蛋白A的可溶性表达及活性检测性[9],提示CLR区完整性 对 其 凝 集 活 性 的 影 响 不大。第二，通过软件模拟cSP-A空间结构发现，尽管cSP-A的茎区较短，但其与猪、人源的SP-A的单体结构极其相似，似乎并 不影 响空间结构的形成。第三，多出了一个未知区，由54aa组成，这一区域的功能有待确定。第四，CRD区不仅有2个糖基化位点，2个钙离子结合位点，还有1个结合甘露糖的基序（215EPN217），这一基序可能会使CRD结合病原微生物糖蛋白的作用更为显着[10].基于这四点不同，有必要对cSP-A的全基因进行表达并进而获得大量可溶性cSP-A蛋白纯品，以研究其基因结构与生物学功能的关系，并期望将来用于临床研究。
　　
　　原核表达系统是获取大量蛋白质的最直接途径，但是cSP-A全基因中有多个大肠杆菌的稀有密码子。为此，笔者曾尝试多种原核表达载体进行表达，但均未获得成功，只有在表达cSP-A基因的部分片段（例如N端区和C端CRD区），且突变了大肠杆菌的稀有密码子后才获得了高效表达，但表达产物均为包涵体，不宜进行生物活性的研究。为此，本研究选择pCold-TF原核 表达载体，该表达载体带有冷休 克 蛋 白A（cspA）启 动 子，融 合 触 发 因 子（TF）、蛋白质水解位点和His标签分子，在低温环境中经IPTG诱导表达，不仅可增强目的蛋白的稳定性，而且有效促进融合蛋白的可溶性表达，便于蛋白质纯化，保证目的蛋白的天然活性[11].最终研究结果显示，cSP-A成熟肽在该载体中获得了高效可溶性表 达；Western-blot结 果 显 示，该 蛋 白 质 可 被cSPA-CRD多克隆抗体特异性识别，表明cSP-A重组蛋白具有良好的反应原性（见图4）。
　　
　　cSP-A与 哺 乳 动 物 源SP-A序 列 的 同 源 性 不高，本研究通过抑菌试验证明：cSP-A蛋白原核表达产物无明显抑菌功能，而天然鸡肺灌洗液SP-A蛋白可高效抑制部分常见革兰阴性菌（巴氏杆菌、甲型副伤寒沙门菌、大肠杆菌）和革兰阳性菌（粪肠球菌、金黄色葡萄球菌）（见图5）。这可能与原核表达产物没有天然蛋白的翻译后修饰，也不能形成三聚体，从而不能发挥天然蛋白的相似活性所致。下一步将通过cSP-A全长真核分泌性表达、杆状病毒载体真核表达系统等途径解决其生物学活性问题。
　　
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