中药研究中在线二维液相色谱的应用(2)

　　相比于全二维的整体模式，中心切割技术只是将第一维分离的部分组分引入第二维，具有较高的针对性，对于中药某些难于分离的成分具有重要意义。例如，由于人参皂苷类化合物的结构极为相似，只用一维色谱无法完全分离，Yao等[31]采用多次中心切割二维色谱实现了中成药中8种人参皂苷类化合物的基线分离与准确定量。由于中药成分中各化合物的含量不同且基质复杂，常将全二维和中心切割技术联用。Qiao等[32]将中心切割和全二维液相色谱技术联用，对葛根中的微量成分进行分析，将中药主成分进行切割移除后，用质谱对相对丰度低的峰进行解析，最终发现了9种新化合物。在后续实验中，该课题组[33]以全二维液相色谱模式在42 min内分离了125种化合物，以中心切割模式针对性地分离了其中13种成分，从而实现了葛根芩连汤的全面物质基础表征。
　　
　　2.2中药活性成分筛选
　　
　　中药是一个复杂的整体，其药效物质基础的阐明离不开相关化学成分的活性评价。传统方法采用先化学分离后活性测试的模式，所需样品量多且耗时、耗力，限制了中药药效物质基础的研究。随着分析技术的发展，基于高灵敏度、高通量分析方法的在线筛选/评价方法大大提高了中药活性成分的发现效率。
　　
　　将多维色谱技术与中药活性成分快速筛选技术结合，可以更好地适应中药多变的复杂体系，也可以明显提高分析和筛选效率。
　　
　　2.2.1在线二维色谱与涡流色谱联用
　　
　　涡 流 色 谱 （turbulent flow chromatography,TFC）是一种利用大粒径（> 25 μm）填料，使流动相在高流速下产生涡流状态的色谱技术，具有保留小分子而不保留生物大分子的特性，可以实现生物样品中待测药物小分子的净化和富集。其作为生物样品分析的前处理技术而得到广泛应用[34].基于TFC建立的样品在线预处理模式是典型的中心切割二维液相色谱模式，其基本过程为：将大分子和小分子化合物混合后上样至TFC柱，首先，大分子化合物被洗脱而小分子化合物被保留；待小分子化合物被洗脱时切入第二维液相色谱柱进行分析。TFC柱和液相分析柱之间主要以六通阀连接，从而完成涡流 色 谱 在 线 净 化 样 品 的 二 维 液 相 分 析。Xin等[35]在建立的涡流色谱在线预处理液相分析系统的基础上，通过加入1%（质量分数）的亲水-β-环糊精（HP-β-CD），提高载体微透析的提取效率，实现了微透析-涡流色谱在线预处理-高速液相色谱分析的二维色谱药物代谢研究模式，具有在线采样、分析速度快、稳定性高等特点，并将其应用于贝母生物碱的药代动力学的研究中。
　　
　　活性生物大分子（酶、受体、载体蛋白等）是小分子药物在体内产生药效的重要生物结合靶标之一。基于与药理靶标结合的化合物具有潜在的活性这一理论，笔者所在课题组通过采用两根TFC柱，建立了以2D-TFC-HPLC-MS为手段的中药活性分子快速筛选技术，其主要原理见图3.由图3可知，将生物活性大分子（如靶蛋白）与中药提取物进行孵育，潜在的活性化合物与靶蛋白结合形成复合物，通过第一维涡流色谱柱，可以将靶蛋白-小分子复合物与游离小分子化合物分离；富集到的靶蛋白-小分子复合物在解离线圈内进行解离，游离靶蛋白和游离小分子进入第二维涡流色谱柱实现分离；获得的潜在活性小分子经过二维液相色谱-质谱系统进行分析，从而快速地从中药复杂成分中筛选出具有目标活性的化合物。将建立的2D-TFC-HPLC-MS法应用于贝母类生物碱中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制剂的筛选，第一维TFC柱为亲水亲脂平衡（HLB）柱，第二维色谱柱为复合阳离子交换（MAX）柱，通过方法优化和验证，筛选出了8种和11种分别能和 乙 酰 胆 碱 酯 酶 （AChE）、丁 酰 胆 碱 酯 酶（BChE）高效结合的贝母类甾体生物碱，并通过半抑制浓度（IC50）的测定，验证其抗胆碱酯酶的活性[36].为扩大2D-TFC-HPLC-MS法的应用范围，改变了TFC的保留机制，第一维采用MAX柱，第二维采用HLB柱，通过方法优化，可对强极性和弱酸性成分进行分析。利用此系统，对丹参水提物中的黄嘌呤氧化酶抑制剂进行筛选，得到3种活性较高的酚酸类化合物，分别为丹酚酸A、丹酚酸C和异丹酚酸C,其中丹酚酸C为首次报道的黄嘌呤氧化酶抑制剂，其活性与阳性药别嘌醇的活性相当[37].所建立的2D-TFC-HPLC-MS系统可使用不同类型的TFC柱实现多种类型成分的分析，并具有较好的普适性；在 该 系 统 中，1D TFC柱 收 集 大 分 子 化 合物，2D TFC柱收集小分子化合物，为TFC分析方法在中药活性成分筛选的应用提供了新思路。
　　
　　2.2.2在线二维色谱与细胞膜色谱联用
　　
　　细胞膜色谱（cell membrane chromatography,CMC）是生物色谱技术中的一种，其原理是将人或动物的活性组织细胞膜固定在色谱载体的表面，制备成细胞膜固定相。药物随流动相进入色谱柱时与细胞膜固定相上的受体发生相互作用，如果与特定的细胞膜受体有特异性结合，就可在细胞膜色谱模型中反映出来。CMC技术是将药物分子在体内与细胞膜受体相互作用过程转换为体外的色谱过程，具有受体亲和色谱分离的双重特性，是研究药物与活细胞相互作用的理想技术[38].CMC从建立之初就因其在中药活性筛选方面体现出的较好优势而受到广泛关注。目前CMC已形成较为完善的技术方法和模型体系，并被广泛应用于多种功效的中药活性成分筛选[39].
　　
　　CMC作为一种生物色谱技术，其色谱分离效率较低，在某种程度上会影响活性成分的检测和辨识。因此构建细胞膜色谱-二维高效液相色谱分析系统，可提高筛选效率。细胞膜二维液相分析系统的原理类似于heart-cutting技术，即第一维CMC筛选出的有效组分流出色谱柱后（紫外检测识别），通过切换阀切换流入第二维色谱柱进行分离分析，用于提高目标活性成分的分辨率和鉴定效率。如第一维色谱柱采用人皮肤鳞癌细胞A431/ CMC柱，第二维用ODS分析柱，中间用二位十通阀并联两个预柱。第一维洗脱的第一组目标成分先进入预柱1进行富集，然后转入ODS柱进行分析，同时第二组成分可以在预柱2进行富集后，再转入ODS柱。采用该系统，从苦参[40]和红毛七[41]中筛选得到了具有表皮细胞生长因子受体拮抗剂活性的生物碱类化合物。第一维采用血管内皮生长因子受体VEGFR-2/ CMC柱，从附子中筛选出有血管表皮生长因子受体活性的生物碱[42].采用乳腺癌细胞MDA-MB-231 / CMC柱，从厚朴中筛选出抗乳腺癌的活性化合物[43].采用大鼠嗜碱性细胞白血病细胞RBL-2H3 / CMC柱，从双黄连注射液中筛选出可能引起过敏反应的物质[44].第一维采用α1A-肾上腺素受体/ CMC柱，并用两个loop环代替富集柱用于筛选红毛七中的α1A-肾上腺素受体拮抗剂[45].二维CMC-液相筛选方法比一维方法的筛选效率高，但CMC馏分的收集/切换依赖于第一维色谱后的检测器信号（通常为紫外信号），存在成分丢失的风险。