近年来miRNA检测方法的研究进展(3)

　　Chen 等[66]将 DSN 酶循环和基于共振能量转移的电化学发光相结合，用于超灵敏检测miRNA. 在预先处理的玻碳电极（GCE）上，Cd S 凝胶被处理成颗粒结构并修饰捕获探针。捕获探针包含三部分结构（图 7中用红色、绿色和蓝色标示）。如果不存在靶 miRNA,纳米金标记的探针 Au-probe 1 与标记Cd S 的捕获探针结合，增强 Cd S 的ECL 信号。当存在靶 miRNA 时，捕获探针的红色区域与miRNA杂交形成双链； DSN 能够选择性地切割双链中的 DNA 结构，释放靶 miRNA,启动下一个循环； 鲁米诺-纳米金标记的探针 L-Au-probe 2 能结合到捕获探针上，猝灭 ECL 信号。因此，靶 miRNA 浓度的增加会导致 Cd S ECL 信号减弱和鲁米诺 ECL 信号增强。该方法利用电化学发光强度比进行定量分析，具有灵敏度高和选择性好等优点，检出限为 0. 24 fmol/L.
　　
　　2结论与展望
　　
　　miRNA 是一类广泛存在于真核细胞中的短片段非编码小分子 RNA,可以调节 mRNA 靶基因的表达； miRNA 的异常表达与人体内很多疾病尤其是癌症的发生密切相关。因此，miRNA 作为一种典型的肿瘤标志物正受到越来越多的关注。miRNA 的超灵敏检测对癌症的早期诊断和抗癌靶向药物的研发具有重要意义[7~10,83]. 但是由于 miRNA 尺寸小、在总 RNA 样品中丰度低且同家族 miRNA 序列同源性高，其超灵敏检测面临许多挑战[18]. miRNA 检测在消除假阳性、提升单碱基突变检测的灵敏度和特异性及区分前体 miRNA 与成熟 miRNA 等方面存在很大的进步空间。目前，临床上应用最为广泛的 miRNA 定量方法依旧是基于 PCR 方法，数字 PCR 因无需参考基因而有望成为下一代 miRNA 绝对定量方法[84].同时，核酸扩增技术在 miRNA 特别是单碱基突变的测定中具有非常大的发展潜力，基于 RCA,SDA 和HCR 等扩增技术的方法展示出很高的特异性和准确度。目前，miRNA 分析正逐步向简单化、特异性、高通量、高灵敏度和多重检测等方向发展，呈现出如下发展趋势： （1） 提取和量化过程的标准化。不同的提取方法可能导致样品中 miRNA 水平因人工处理而有所差异[85,86]. 同时，不同量化方法之间存在偏差，会直接影响分析数据的可信度，因此建立标准化的提取和量化过程至关重要。（2）miRNA 的同时多重检测。在实际应用中，由于样本数目少，单一检测常常会导致选择性偏差[87]. 同时测定多种miRNA可以提高分析的可信度，显着提高疾病诊断的准确性。（3）纳米材料的应用。纳米材料具有独特的催化活性、导电性和生物相容性，能够加速信号传导。通过将金属纳米材料[55,57,65]和量子点[61,62,88]与 miRNA 分析方法相结合，可进一步提高检测灵敏度，实现 miRNA 的超灵敏检测、甚至单个分子检测。（4）可靠内源性参照物的筛选。目前，在血清和血浆中定量检测循环 miRNA 时，常常缺乏可靠内参。今后需进一步筛选稳定可靠的内参用于循环 miRNA 的测定[89]. （5） 原位检测。研究表明，miRNA从不单独发挥作用，但是目前多数 miRNA 检测方法需要将 RNA 分离后才能进行检测[90],因此发展miRNA 原位检测方法有助于提高 miRNA 分析的准确度和阐明 miRNA 的作用机制。
　　
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