MicroRNA（miRNA）是一类长约为 22 个核苷酸（ nt）的内源性非编码小分子单链 RNA,普遍存在于真核细胞中[1]. miRNA 由长约 70 nt 具有茎环结构的 microRNA 前体经核酸酶 Dicer 剪切产生[2]. 在细胞增殖、分化和肿瘤发生时，通过 RNA 诱导沉默复合物（RISC）的协调作用[3,4]1,从而调控靶基因的表达。自Lee 等[6]在 1993 年首次从线虫中发现了真正意义上的miRNA-lin-4 以来，研究者已经确定了人类基因组中超过 450 种的 microRNA. miRNA 可以控制超过 50%人类编码基因的活性，在生物发育、细胞分化、凋亡、增殖和免疫等生物过程中发挥着至关重要的调控作用[7~10]. miRNA 在人体组织和血液中的异常表达与癌症的发生、发展和治疗反应密切相关[11~15]. miRNA 可作为癌症诊断和预测的生物标记物，也可作为新药物的潜在作用靶点[16,17]. 因此，miRNA 的超灵敏检测有助于临床早期诊断与抗癌药物的研发。然而，由于 miRNA 片段小、在细胞中表达量低和序列同源性高，致使 miRNA 的超灵敏检测面临许多挑战[18].
传统的 miRNA 分析方法包括 Northern 印迹杂交法[19~21]、微阵列分析法[22~25]和实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）[5,16,26,27]等，这些方法准确度高、应用广泛，但也存在一些不足。Northern 印迹杂交法耗时费力、灵敏度低、样品需求量大，且不能用于低丰度miRNA 的测定。 微阵列分析方法可用于发现新的 miRNA[28],并且可实现 miRNA 的多重检测，但其灵敏度较低[22]、特异性较差、动态范围较窄、芯片制作和检测费用高[29]且重复性差。qRT-PCR 操作简单、灵敏度高[30,31],但 miRNA 序列较短限制了其逆转录环节[32],且 qRT-PCR 通常需要复杂的引物设计和精确的温度控制[33]. 另外，PCR 过程中非特异性扩增也容易导致假阳性[34].
近年来，发展了许多新的 miRNA 分析方法，显着提高了检测灵敏度。这些方法引入了生物发光[35~37]、酶分析[38~40]、分子信标[41]、深度测序[42]以及基于锁核酸[43,44]和桥连链式反应[45],但依然存在一些无法避免的缺陷。生物发光法[35,36]使用生物发光蛋白 Renilla 荧光素酶作为标记物，操作简单，但其分析原理基于发光信号的减弱。酶分析法[39]具有信号放大效果好的优点，但特异性和灵敏度相对较低。深度测序[42]可用于快速定量分析 miRNA 的绝对水平，但是检测成本较高。基于锁核酸和桥连链式反应的分析方法需要固定 /分离步骤[43]和设计复杂的 DNA 探针[45],限制了其应用。
由于 miRNA 长度短且丰度低，需要引入信号放大来提高miRNA 检测的灵敏度。 研究者先后将杂交链式反应（Hybridization chain reaction,HCR）、滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）及链置换扩增（ Strand displacement amplification,SDA）等扩增反应与比色分析[46~49]、荧光[41,50~52]、化学发光[53~56]、表面增强拉曼[57~60]、单分子检测[61~63]和电化学分析[64~66]结合起来，实现了 miRNA 的超灵敏检测。本文结合本课题组的工作对近年来 miRNA 检测方法的进展进行了较为全面的评述。
1 miRNA检测方法
1.1比色法
比色法可依据颜色变化对 miRNA 进行定量分析，具有操作简单、结果直观、成本低以及灵敏度高等优点[67]. 近来，具有催化活性的 DNA 酶和纳米金颗粒的引入使比色法展示了更大的发展空间[68].纳米金颗粒在分散状态下显红色，团聚后显蓝色，可用于 miRNA 的快速检测[69]. Zou 等[46]将催化发夹组装（CHA）与 HCR 相结合，实现了 let-7a miRNA 的免标记、无酶分析。他们设计了 4种发夹探针，分别是 H1,H2,H3 和H4. 当没有目标 miRNA 时，4个探针在溶液中保持稳定的发夹结构，不产生放大信号。当存在目标 miRNA 时，目标 miRNA 首先结合并打开探针 H1;接着，探针 H2 与H1 杂交形成H1-H2 双链，并释放 miRNA,启动下一个循环，引发 CHA 反应。同时，CHA 反应形成的 H1-H2 双链可与探针 H3 杂交，启动 HCR 反应，打开探针 H3 和H4,产生大量 G-四联体结构。G-四联体结构在辅因1NA 酶，可催化 H2O2将无色 ABTS2-离子氧化成绿色ABTS-离子，产生颜色变化。该方法无需使用蛋白酶和化学修饰，成本低，可在等温均质条件下进行，避免了复杂的分离程序和耗时的热循环。通过 CHA 和HCR 双重信号放大，检出限可达 7. 4 fmol/L,检测范围跨越 6个数量级（10-14~ 10-8mol / L），并可区分靶序列中单个碱基的差异，在疾病诊断中具有潜在应用价值。另外，Jiang 等[47]将等温扩增技术 SDA 和DNA 酶相结合，应用 ABTS 比色定量检测miRNA,检出限低至 0. 5 fmol / L.
纳米金比色法也广泛应用于 miRNA 分析。Gao 等[48]利用纳米金颗粒和双链特异性核酸酶（DSN），实现了 miRNA 的实时、免标记分析。在无目标 miRNA 存在时，纳米金通过 DNA 探针交联成网状，呈现红色。在目标 miRNA 存在时，DNA 探针可识别并结合目标 miRNA,形成双链； 此双链中的 DNA 序列随后被 DSN 特异性识别并切割，释放 miRNA 和纳米金颗粒，使溶液呈现紫色。释放的目标 miRNA可以继续和核酸探针杂交，在 DSN 作用下引发等温扩增循环，放大检测信号。该方法无需标记，可在恒定温度下扩增，检出限低至 10-16mol / L. Ye 等[49]也报道了将纳米金颗粒和 DSN 相结合用于序列特异性 miRNA 的比色分析。该方法具有无需分离和选择性好的优点，检出限为 16 pmol/L.
1.2荧光检测
目前报道的荧光检测法主要使用 SYBR Green Ⅰ，SYBR Green Ⅱ等荧光染料或 2-氨基嘌呤等荧光探针，对目标 miRNA 经核酸扩增后产生的产物进行定量分析[70,71]. Zhang 等[41]开发了基于发夹探针的循环指数扩增方法，用于超灵敏检测 miRNA（图 1）。靶miRNA 可在 Vent（exo-）DNA 聚合酶和 dNTPs存在下，延伸 DNA 模板，随后在切口酶 Nt.Bst NBI 的作用下启动第一个 SDA 反应，产生大量通用的触发链。通用的触发链可与同时带有荧光基团和猝灭基团的发夹型探针 3‘末端进行杂交，通过延伸反应打开发夹型探针，导致荧光基团和猝灭基团分离，产生荧光信号。另外，通用的触发链可作为引物引发第二个 SDA 反应，产生可以作为第一个 SDA 反应引物的新触发链，使 2个SDA 反应得以循环往复，形成循环指数扩增，产生放大荧光信号。该方法利用延伸反应（而不是常用的由热力学平衡控制的杂交反应）打开发夹探针，极大地简化了实验设计。由于引入循环指数扩增，此法检出限低至 0. 38 pmol/L,并可应用于实际样品中 miRNA 的定量分析。
Zhang 等[50]还开发了一种双功能 SDA 介导的超分支滚环扩增（ HRCA）方法，用于超灵敏检测let-7a miRNA. 实验原理如图 2所示： 靶 miRNA 与线性模板杂交后引发延伸反应，随后在切口酶Nb.Bsm I的辅助下引发双功能 SDA 反应，产生的大量 DNA 片段可作为第一和第二引物引发 HRCA 反应。HRCA 产物可利用荧光指示剂 SYBR Green Ⅰ进行检测。此方法利用双功能 SDA 反应同时产生了2 种可作为HRCA 反应引物的触发物，实验过程中无需特别设计其它引物，检出限低至 0. 18 pmol / L,且选择性好，可直接用于分析人体肺组织中总 RNA,在临床疾病诊断中具有潜在应用价值。
值得注意的是，Zhang 等[51]利用发夹型探针介导的滚环扩增（HP-RCA）实现了对肺癌血清中循环miRNA 的超灵敏检测。在该方法中，靶 miRNA 可与发夹型探针杂交，打开发夹，裸露出能与环形模板结合的部分，可在 phi29 DNA 聚合酶作用下引发 RCA 反应。RCA 反应产生的单链 DNA 产物可用 SYBRGreen Ⅱ染料进行定量分析。该方法实验操作简单，无需 miRNA 纯化过程，能够准确区分非小细胞肺癌（NSCLC）患者和健康人中血清 miR-486-5p 的不同表达水平，检出限达 10-14mol / L,可应用于肺癌的早期诊断。
Zhang 等[52]还利用 2-氨基嘌呤探针建立了免猝灭荧光法，用于检测人体肺组织中 let-7a miRNA.腺嘌呤代替物 2-氨基嘌呤能发出荧光，但其荧光信号会被相邻堆积的碱基猝灭。如图 3所示，靶miRNA可作为引物与 2-氨基嘌呤探针结合，在 KF 聚合酶作用下引发延伸反应，产生双链 DNA,并释放辅助 DNA. 双链 DNA 中含有 2-氨基嘌呤的链被 Nb.Bts I 切口酶和 λ核酸外切酶切割，释放出游离2-氨基嘌呤分子，产生荧光信号。若不存在靶 miRNA,KF 酶无法发挥作用，切口酶无法完成切割，因而不会产生荧光信号。该方法不需引入新的猝灭剂，辅助 DNA 的引入显着增强了检测信噪比，检出限低至 0. 3 fmol/L,可直接用于肺癌组织中的 miRNA 分析。
1.3化学发光检测
化学发光分析利用化学发光物质由激发态跃迁回基态时发出的光信号进行定量分析[72]. 因为无需外加光源，化学发光分析具有灵敏度高、操作方便及易于实现自动化等优点[73],在生化分析领域应用广泛[74]. 化学发光分析与扩增技术联用可以实现 miRNA 的超灵敏检测。Ye 等[53]将基于聚多巴胺（PDA）纳米球的化学发光共振能量转移（CRET）和基于 DSN 的信号扩增相结合，用于 miRNA 的定量分析。他们设计的探针含有 2个区域： 区域Ⅰ是靶 miRNA 的互补序列，探针通过此区域与 PDA 结合；区域Ⅱ是信号序列，可与氯高铁血红素组装成具有酶活性的 DNA 酶。 在靶 miRNA 存在时，探针区域Ⅰ与 miRNA 杂交形成部分双链结构，在 DSN 作用下探针区域Ⅰ被循环降解，从 PDA 纳米球中释放出大量 DNA 酶，催化鲁米诺和过氧化氢反应产生化学发光信号。在无靶 miRNA 存在时，DSN 无法进行切割，DNA 酶产生的化学发光信号经 CRET 反应被 PDA 猝灭。因此，化学发光信号的强弱可用于指示靶miRNA 的丰度。该方法无需添加有机染料或标记物，能辨别单碱基差异，具有易操作和低成本的优点，可用于检测生物样品中 miR-122,检出限达 49. 6 pmol/L.
Yeung 等[54]将 poly（U）聚合酶催化的 miRNA 聚合作用与化学发光显微成像相结合，用于超灵敏检测 miR-20. 首先将与靶 miRNA 互补的锁核酸（LNA）探针固定在盖玻片上。miRNA 和锁核酸互补杂交，在 poly（U）聚合酶和 UTP 存在下延伸，产生大量焦磷酸酯（PPi）。 PPi 与ATP 酶、硫酸铵、荧光素和荧光素酶混合，产生化学发光信号。化学发光信号的强度可用于指示靶 miRNA 的浓度。此方法的检出限为 50 fmol/L,如增加曝光时间可进一步提高检测灵敏度。利用不同的捕获探针，并结合生物传感器阵列，可实现 miRNA 的多重检测。
