近年来miRNA检测方法的研究进展(2)

　　Zhang 等[55]将基于硫化铜纳米颗粒（Cu S NP）和硝酸银的阳离子交换反应应用于化学发光检测miRNA（图 4） .所设计的探针序列含有适配体区域和 miRNA 特异区域，并将探针固化在磁珠上。靶miRNA 可与 miRNA 特异区域结合，在 T4 连接酶的作用下与适配体区域结合，使之固定在磁珠上得以分离。连接的适配体区域可作为引物，启动 RCA 扩增，其产物可捕获标记 Cu S NP 的特异 DNA 序列。在室温下加入硝酸银溶液，几分钟内便可完成铜离子和银离子的阳离子交换反应，释放的铜离子能催化鲁米诺和过氧化氢反应，产生化学发光。不存在靶 miRNA 时，因为解链温度低于反应温度，连接的适配体区域无法与磁珠上的 DNA 探针进行杂交，RCA 无法启动，没有 Cu S 纳米颗粒被捕获，因而不会发生阳离子交换反应，无化学发光信号产生。RCA 的引入使该方法灵敏度提高了 100 倍，检出限达0. 17 fmol / L. 该方法具有特异性和选择性好、低成本、无毒性、响应快速且循环可再生等优点，可用于实际样品中 miRNA 分析。
　　
　　Lu 等[56]将变构发夹型 DNA 开关和杂交链式反应相结合，用于超灵敏检测 miRNA. 所设计的发夹探针由靶 miRNA 结合序列和 2个茎序列---链霉亲和素（SA）适配体序列和 HCR 触发序列构成。当存在let-7a miRNA 时，发夹型 DNA 开关探针与靶 m1合打开，暴露其 2个茎序列。HCR 触发序列可作为引物，启动 HCR 反应； 链霉亲和素（SA）适配体序列可与包覆在磁性颗粒上的链霉亲和素结合，分离 HCR 扩增产物。HCR 扩增产物中的 G碱基可与化学发光试剂 3,4,5-三甲氧基苯甲酰甲醛（TMPG）反应，产生化学发光信号。该方法灵敏度高（检出限为 10-16mol / L），特异性好，可直接检测人肺细胞中 let-7a miRNA. 改变适配体序列可实现对其它 miRNA,甚至蛋白质的检测。
　　
　　1.4表面增强拉曼散射检测
　　
　　表面增强拉曼散射（SERS）利用信息丰富的振动光谱识别靶目标，具有高分辨率和高灵敏度等优点[75]. SERS 产生的窄峰有利于多种物质的同时检测[76],已广泛应用于生物医学分析。应该指出的是，尽管 miRNA 可以被 SERS 直接识别，但其结构的高度相似性会产生难以辨认的重叠峰。Zhang 等[57]将等温指数扩增和 SERS 相结合，用于人肺癌细胞中 miRNA 的定量分析。如图 5所示，所设计的模板中包含与靶 miRNA 互补的序列 X和2段相同的触发物序列 T,当存在靶 miRNA 时，miRNA 作为引物和X 序列结合形成局部双链，在 Vent（exo-）DNA 聚合酶作用下延伸并引发 EXPAR 反应，产生大量触发器； 这些触发器可与报告探针及纳米金颗粒修饰的捕获探针形成三明治结构，纳米金颗粒表面附着的大量捕获探针可显着增强报告探针的拉曼散射信号。该方法可用于 miR-205 分析，检出限达 0. 5fmol / L,具有准确度高和再现性好等优点。该方法可进一步应用于细胞内多种 miRNA 的同时检测，并且能从序列高度同源的 miRNA 混合物中辨别出靶 miRNA.
　　
　　Yang 等[58]发现，在单壁碳纳米管（SWNTs）表面原位修饰上带有 DNA 模板的纳米银颗粒（Ag NPs）后，SWNTs 展现出良好的 SERS 效应。他们利用 SWNT. Ag NPs 杂交纳米复合材料和 SERS,对人乳腺癌细胞粗提物中的 miRNA 进行了定量分析，检出限为 5pmol/L. 另外，Yang 等[59]发展了一种免酶的二次 SERS 信号扩展方法，可对人体血清中循环 miRNA 进行定量分析。该方法结合了 SERS,HCR 和银离子介导的串联信号扩增，检出限达 0. 3 fmol/L,可进一步应用于慢性淋巴细胞白血病患者血清中循环 miRNA 的分析。Driskell 等[60]将银纳米棒阵列和 SERS 相结合，建立了 miRNA 的免标记分析方法。该方法基于单链 RNA、硫醇化 RNA 和RNA-DNA 杂交双链对银纳米棒阵列亲和力不同的原理，检出限为 28 nmol/L.
　　
　　1.5单分子检测
　　
　　单分子检测（SMD）可在单分子水平对目标物进行超灵敏检测[77],具有灵敏度高和样品用量少等优势，可在单分子水平上揭示各类生命现象的本质。SMD 的空间尺度一般在纳米级，适合与量子点等纳米材料联用，从而实现目标物的超灵敏测定[78]. 量子点具有独特的光学性能、可调节发射光谱及较高量子产率，常作为荧光标志物和荧光共振能量转移（FRET）的供体，应用于生物标记、荧光成像和药物传递研究等领域。Zhang 等[61]将单个量子点纳米传感器和引物介导的滚环扩增（PG-RCA）相结合，用于肺癌患者组织样品中 miR-196a2 点突变分析。检测原理如图 6所示： 当存在 miR-192a2T 时，其特异性的线性挂锁探针 3’末端和 5‘末端在连接酶的作用下，会形成环状引物，引发 RCA 反应； 在 Vent（exo-）DNA 聚合酶辅助下，RCA 反应产生的重复性序列能被 Nb.Bsm I 切口酶切割，产物随后和生物素/Cy5 双标记的捕获探针杂交形成双链 DNA;双链 DNA 能被 Nt.Bst NBI 切割，导致捕获探针中 Cy5 和生物素分离，无法发生荧光共振能量转移（FRET）。 当存在 miR-192a2C 时，miR-192a2T 特异性探针不能完成环化，无法触发 RCA 扩增反应，因而生物素/Cy5 标记的捕获探针会自组装到量子点表面，引发量子点和 Cy5 之间的 FRET. FRET 信号可用于 miR-192a2T 的定量分析。与此相似，设计 miR-192a2C特异性线性挂锁探针可用于检测 miR-192a2C. 该方法具有较高灵敏度，检出限可达 50. 9 amol/L,比PCR 方法提高 4个数量级[79].
　　
　　Zhang 等[62]进一步将单个量子点纳米传感器和两级指数扩增相结合，用于超灵敏检测 miRNA. 两级指数扩增涉及 2个模板和两级扩增反应： 第一个模板和靶 miRNA 杂交后，在 Vent（exo-）DNA 聚合酶的辅助下得到延伸，形成含有切口酶 Nt.Bst NBI 识别位点的双链 DNA;双链 DNA 随后经 Nt.Bst NBI切割，产生的单链 DNA 可作为引物引发第二个模板的延伸，产生报告寡核苷酸，引发指数扩增反应。报告寡核苷酸与捕获探针、报告探针杂交，形成三明治杂交结构并自组装在量子点表面，形成量子点-报告寡核苷酸-Cy5 复合物。在488 nm 激光激发下，量子点和 Cy5 之间发生 FRET,产生 Cy5 荧光信号，可用于 miRNA 的定量分析。值得注意的是，该方法中两级指数扩增在等温条件下进行且扩增效率非常高，单量子点纳米传感器的背景干扰几乎为零，检出限可达 10-19mol / L. 另外，不同靶 miRNA 可转换为相同的报告寡核苷酸，可用于 miRNA 的多重检测。
　　
　　Li 等[63]建立了基于单微珠的传感平台，可在单分子水平上检测 miRNA. 他们引入等温指数扩增和单个微珠实现信号放大和荧光增强，只需 5μL 样品便可以完成测定，检出限达 10-18mol / L. 该方法选择性好，能识别 miRNA 单碱基差异，可应用于单个细胞中 miRNA 分析。
　　
　　1.6电化学检测电化学分析法包括电导法、库仑法、电位法和伏安法等，具有灵敏度高、选择性好、简捷和经济等优点，广泛应用于各种物质的定量分析[80]. 电致化学发光（ ECL）通过在电极上施加一定电压，发生电化学反应，进而激发电子转移反应，产生化学发光。电致化学发光检测具有背景干扰近乎为零、反应时间和空间可控等优势[81],有望成为一种高灵敏、高选择性的分析方法[82]. Zuo 等[64]利用四面体 DNA纳米探针，将 HCR 扩增和电化学传感相结合，用于超灵敏检测 miRNA. 首先将四面体 DNA 纳米探针固定在金电极表面。靶miRNA 与探针结合，触发链霉亲和素标记的发夹 H1 和H2 发生 HCR 反应。HCR 产物能与亲和素修饰的辣根过氧化物酶结合，产生电催化信号。该方法灵敏度高，检出限达 10-17mol / L. 另外，四面体 DNA 纳米探针能够快速合成，保证分析的再现性； 同时，利用四面体作为支架固定识别探针可提高反应的活性和操作性。与此相似，Chen 等[65]将固定在金电极上的拱形探针和等温指数扩增相结合，建立了免标记电化学法，可用于 miRNA 分析。靶miRNA 能够和拱形探针的对应链竞争反应，释放互补序列，导致金电极上仅剩 DNA 酶序列。DNA 酶序列通过与氯高铁血红素结合形成具有催化活性的 G-四联体复合物，产生电化学信号。同时，miRNA 和互补链形成的双链结构，可启动 SDA扩增生成大量与 miRNA 相同序列的 DNA,启动下一个循环。该方法检出限为 5. 36 fmol/L,可用于肿瘤细胞中 miRNA 分析。