上颚腺( mandibular gland) 是昆虫重要的外分泌腺,位于昆虫头内两侧,为一对囊状腺体,与上颚相连,开口于上颚基部 ( Snodgrass,1956; Cruz-Landim and Mello,1967) ,一般分为分泌部和储存囊2 部分 ( Vallet et al.,1991; Lensky and Cassier,1995) 。上颚腺的分泌活动以及腺体功能同蜜蜂的蜂型以及年龄有关 ( Gracioli-Vitti and Abdalla,2006) ,其产生的化学物质在昆虫的种内信息交流中起重要作用。
关于蜜蜂科上颚腺的结构、发育以及功能,国内外学者进行过许多研究。杜兰芝和张晓萍( 1990)对中华蜜蜂 Apis cerana cerana 上颚腺超微结构的比较研究表明,成年工蜂的上颚腺呈囊状,胞内管和胞外管的管壁由 3 层结构组成,上颚腺细胞的超微结构与咽下腺类似。无刺蜂 Melipona bicolor bicolor 不同蜂型的上颚腺在大小和功能上都有差异: 蜂王的上颚腺最发达,能产生大量的“蜂王物质”,在蜂群中起信息素的作用; 工蜂其次; 而雄蜂的上颚腺最不发达,退化成小囊 ( Gracioli-Vitti and Silva deMoraes,2002) 。麦蜂 Scaptotrigona postica 工蜂和雄蜂的上颚腺在组织结构上没有明显差异,但是腺体细胞的超微结构在不同性别和年龄存在差异( Gracioli-Vitti and Abdalla,2006) 。麦蜂 Meliponaquadrifasciata anthidioides 的上颚腺是由上颚内陷形成的,在预蛹早期就已经开始分化( Cruz-Landim andMello,1967) 。此外,在蜜蜂蜂群中,工蜂的行为不只受到产卵蜂王上颚腺分泌物的影响,还受到不同年龄未受精蜂王的影响( Wossler et al.,2006) 。但是关于中华蜜蜂三型蜂上颚腺组织形态的比较以及胚后发育状况未见报道。
本研究通过组织形态学、BrdU ( 5-bromo-2-deoxyuridine) 免疫组织化学 ( BrdU incorporation) 技术,对中华蜜蜂 A. c. cerana 不同蜂型上颚腺的组织结构以及工蜂上颚腺胚后发育的过程进行了比较研究,为昆虫上颚腺的结构和功能研究以及昆虫社会行为的研究提供一定的理论依据。
1、 材料与方法
1. 1 供试材料
实验所用的中华蜜蜂蛹及成虫均购自秦岭大峪中华蜜蜂养殖基地,所取材料来自同一蜂群,包括: 1 -2日龄预蛹( PP1 -PP2) ;1 -9 日龄蛹( P1 - P9) ; 成虫包括采集工蜂,处女蜂王和产卵蜂王,以及未交配雄蜂。
1. 2 苏木精-伊红染色( hematoxylin-eosin staining,HE 染色) 组织化学方法
中华蜜蜂工蜂、蜂王、雄蜂的成虫各 3 ~5 头,取头部,多聚甲醛 4℃固定过夜。梯度酒精脱水,二甲苯透明。石蜡包埋,横向连续切片,切片厚度 5 ~ 7μm,切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,烘干备用。切片脱蜡后复水,HE 染色,OLYMPUS( BX51)显微镜观察拍照。
1. 3 BrdU 免疫组织化学方法
1. 3. 1 BrdU 掺入处理: 取中华蜜蜂工蜂的预蛹、1- 9 d 蛹和成虫活体各 3 ~ 5 头,从头部触角基部注射约 3 μL 浓 度 为 25 mg/mL 的 BrdU ( B9002,Sigma) ,掺入时间为 8 h。
1. 3. 2 BrdU 免疫组织化学染色: 将 BrdU 处理过的预蛹及蛹和成虫取头部,4% 多聚甲醛 4℃固定 8h。70% ,80% ,90% ,95% 和 100% 梯度酒精脱水,石蜡包埋,横向连续切片,厚度为 7 μm。切片裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,烘干备用。
切片用二甲苯脱蜡,入梯度酒精复水; 抗原修复,磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline,PBS)洗 3 次; 3%过氧化氢封闭内源性酶 10 min,Tris-HCl缓冲液( Tris-HCl buffered saline,TBS) 洗 3 次; 滴加正常山羊血清封闭液,37℃ 30 min; 滴加小鼠 BrdU单克隆抗体( 1/200) ( ab8039,ABCAM) ,湿盒中4℃孵育过夜,PBS 洗 3 次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37℃ 120 min,PBS 洗 3 次; 滴加过氧化物酶37℃ 孵育 30 min,PBS 洗 3 次; 二氨基联苯胺 ( 3,3’-diaminobenzidine,DAB) 显色后镜检,中性树胶封片,Nikon 数码显微成像系统( DS-5M) 拍照。阴性对照以 PBS 代替一抗。
1. 4 数据统计与分析
1. 4. 1 细胞计数: 为了评价上颚腺在发育过程中细胞的增殖情况,对切片上 BrdU 标记的增殖细胞( 8 h掺入) 的数量进行计数( 7 μm 切片) 。通常切片上标记的细胞核的数量同细胞的数量是成比例的,比例系数依赖于切片的厚度,细胞的大小、形状以及核的方位。校正公式为 C =c[t/( t +d) ],C 是校正数,c 为原始数 据,t 为 切 片 厚 度,d 是 细 胞 核 的直径( Abercrombie,1946) 。每一时间点计数3 ~5 头蜜蜂的5 ~8 个上颚腺,计算其平均数,误差值为标准误( SE) 。
1. 4. 2 数据分析: 利用 TSView 7 图像分析软件测量上颚腺的面积及分泌细胞和细胞核的直径; 利用Excel 计算平均值及标准误。
2、 结果
2. 1 中华蜜蜂成虫上颚腺的组织结构
中华蜜蜂工蜂的上颚腺倒三角形,位于头的两侧,大颚的上方( 图 1: A) 。分泌细胞构成的腔壁和腺腔之间有内膜分隔,腔内充满分泌物; 腔壁上有气管孔( 图 1: B) 。分泌细胞扁长形或立方形,胞质强嗜碱性,胞核圆( 图1: C) 。蜂王的上颚腺长囊状,面积明显大于工蜂( 图1: D) ( 表 1) 。处女王腺腔中的内膜明显,由扁平上皮细胞组成; 在内膜和分泌胞壁之间充满嗜酸性分泌物( 图 1: E) ,并零散分布有球形细胞,胞质中有强嗜酸性颗粒( 图1: F) ; 分泌细胞立方形,胞核圆; 胞质强嗜碱性,细胞边缘的胞质中分布有许多小泡; 每个分泌细胞的一端有胞外管通入腺腔; 胞内管明显( 图 1: F) 。产卵王的上颚腺大于处女王( 表 1) ,外形不规则,具有许多皱褶( 图 1:G) ; 分泌细胞肥大,柱状,胞质嗜酸性; 胞核圆形,染色质颗粒散在核质中; 胞外的腺腔中有分泌颗粒( 图1: H,I) ; 每个细胞有胞外管和胞内管( 图 1: I) 。雄蜂的上颚腺最小( 表1) ,椭圆形,较为退化( 图 1: J) ;分泌细胞形态不完整或者很不规则,无法测量其大小; 胞核小,球形; 内膜紧贴胞壁( 图1: K,L) 。
2. 2 中华蜜蜂工蜂上颚腺的胚后发育在中华蜜蜂幼虫发育末期,上颚腺的雏形开始出现,具有腺体部和分泌管 2 部分,腺体细胞柱状,胞核整齐的排列在细胞基部( 图 2: A) 。预蛹发育早期( PP1) ,腺体开始分化,腺细胞和管细胞都在分裂,但是并不活跃( 图 2: B) 。到预蛹发育晚期( PP2) ,上颚腺的体积有所增大,分裂细胞逐渐增多( 图 2: C) ( 图 3) 。到 P1 时,每一个胞核均呈 BrdU反应阳性,说明腺体细胞开始快速增殖( 图 2: D)( 图 4) ,但是上颚腺的面积增加得并不快( 图 3) 。
到 P2 时,上颚腺分泌细胞细胞质增多,细胞体积变大,细胞由多层、散乱、重叠排布变为单层规则排列,数量较少,胞核圆; 内膜与分泌细胞分离,进入腺腔( 图 2: E) 。上颚腺细胞的分裂活动一直持续到蛹发育的第 5 天以后( 图 2: F,G) 。到蛹发育的第 6天,细胞的分裂活动已经停止,但是面积却快速增加( 图 2: H) ( 图 3) 。到第 8 天时,上颚腺的形状已经类似于成虫,但是腺腔中没有分泌物( 图 2: I) 。
3、 讨论
3. 1 蜜蜂上颚腺的组织结构及功能比较
上颚腺是蜜蜂重要的外分泌腺,蜂王上颚腺的分泌物———蜂王上颚腺信息素( queen’s mandibulargland pheromone,QMP) 在蜂群生活中有重要的调控作用( Snodgrass,1956) 。中华蜜蜂三型蜂的上颚腺在腺体大小和分泌细胞的形态上,差异非常显著( 表 1) 。蜂王的上颚腺最大; 其次是工蜂; 雄蜂最小,退化成小囊状。这同其他蜜蜂种类类似( Cruz-Landim and Mello,1967; Gracioli-Vitti and Silva deMoraes,2002) 。中华蜜蜂产卵王的分泌细胞肥大,并且具有大的胞核,其中散布有明显的染色质,说明了它们具有旺盛的分泌活动; 雄蜂的上颚腺很小,并且有退化的趋势,是由于它们的分泌物少,只在同蜂王的婚飞交配时起作用的缘故( Lensky et al.,1985) 。
蜜蜂上颚腺的分泌活动以及腺体功能具有级型和年龄依赖性。中华蜜蜂的工蜂和蜂王羽化后,上颚腺即开始分泌活动,分泌物通过胞外管直接注入腺体壁和内膜之间的空间积累起来。本研究结果显示,中华蜜蜂工蜂和刚羽化的处女王上颚腺分泌细胞的形态比较相似,胞质中都含有大量的嗜碱性颗粒,并且都聚集在胞内管的周围,说明了它们在分泌功能上较为相似。Gracioli-Vitti 等( 2005) 对无刺蜂M. bicolor 的工蜂和处女王上颚腺的分泌物成分进行的比较研究也显示,它们的成分较为相似,含量最高的都是 10-羟基-2-癸烯酸[( E) -10-hydroxydec-2-enoic acid,10-HAD]。一般认为,工蜂上颚腺中的10-HDA 主要是作为蜜蜂幼虫的食物,此外还与采集有关,并且可以作为诱导信息素参与调节工蜂开始担任采集任务日龄的大小( Callow and Johnston,1960) ,因此工蜂在成蜂阶段,上颚腺始终具有一定分泌功能,在不同职能的个体间差异不大。但是蜂王上颚腺的发育却同年龄有关,随着年龄的增长,蜂王即使不交配,上颚腺中的分泌物成分也会发生变化。研究表明,老龄处女王和产卵蜂王上颚腺中含量最高的成分均为 9-羟基-2-癸烯酸( 9-hydroxy-2-decenoic acid,9-HDA ) 和 9-氧-2-癸烯酸 ( ( E ) -9-oxodec-2-enoic acid,9-ODA) ,也正是这些成分,执行了 QMP 的主要功能,包括抑制工蜂培育新蜂王;吸引工蜂聚集到蜂王周围; 刺激新分蜂群采集花粉、培育幼蜂; 推迟工蜂从事巢内活动到巢外活动的行为转换( Pankiw et al.,1996) 等。我们在处女蜂王上颚腺细胞边缘的胞质中看到了有大量的脂滴,也表明了蜂王和工蜂上颚腺在分泌物成分上的差别,那些脂滴储存了蜂王分泌物中的脂质成分。中华蜜蜂工蜂和蜂王上颚腺的差异同蜜蜂总科( Apoidea)的其他一些种类类似( Gracioli-Vitti et al.,2004) 。
但是在 S. postica 工蜂上颚腺的分泌细胞和管腔中,始终都有脂类物质存在,并且不依赖于个体的行为转变( Gracioli-Vitti et al.,2004) ,而中华蜜蜂只在处女王中较为明显,在工蜂和产卵蜂王却很少看到,这说明了不同的蜜蜂种类其上颚腺分泌物的组成和成分上存在差别。
上颚腺的腺腔中有一层由扁平细胞组成的内膜,在分泌细胞壁和腺腔之间形成一层独立空间,这个空间承担了暂时储存分泌细胞分泌物的功能,而这个功能在 S. postica 工蜂是由分泌细胞中的小管周区域( pericanalicular area) 来承担的( Gracioli-Vittiet al.,2004) 。中华蜜蜂工蜂和雄蜂的内膜不规则,紧靠着分泌细胞壁,之间的空隙较小,尤其是雄蜂,这可能是由于它们的分泌物较少的缘故。蜂王的这个区域却比较宽阔,并且充满了嗜酸性分泌物,但是在腺腔中却没有,说明在此时分泌物还没有进入腺腔,它们只是为后续的分泌活动做准备。此外在腔壁和内膜之间还散布有许多小球形的细胞,这些细胞的胞质中具有大量的强嗜酸性颗粒,类似于小型的脂肪体细胞,这种细胞在工蜂和雄蜂很少看到,它们的功能可能是储存分泌细胞的分泌物。但是关于这种细胞在其他的昆虫类型没有见到报道,其功能还需进一步的实验研究证明。
中华蜜蜂同西方蜜蜂在上颚腺的面积和分泌细胞的大小上差别较大。中华蜜蜂工蜂上颚腺的面积( 约为 135 000 μm2) 小于西方蜜蜂 Apis mellifera( 约为 302 000 μm2) ; 分泌细胞的大小( 工蜂为 20 ~ 30μm,蜂王为 40 ~ 60 μm) 也小于西方蜜蜂( 工蜂为40 ~ 70 μm,蜂王为 50 ~ 90 μm) ( Salles and Cruz-Landim,2004) 。这一方面是由于中华蜜蜂的个体本身小于西方蜜蜂,另一方面可能同它们的功能差异有关: 中华蜜蜂不采集和利用蜂胶 ( 杨冠煌,1973) ,所以工蜂的上颚腺也就不分泌西方蜜蜂工蜂分泌物中含有的溶解蜂胶的物质; 同时由于中华蜜蜂的产浆力远远不如意蜂,所以上颚腺中分泌的参与王浆组份的一些生物激素也较少。此外中蜂蜂王的上颚腺也小于西方蜜蜂,这也可能是造成中蜂相较于西方蜜蜂,蜂群较为松散,分蜂性强以及失王后工蜂更易产卵( 杨冠煌,1973) 等的原因之一。
3. 2 中华蜜蜂上颚腺胚后发育的特点
中华蜜蜂的上颚腺最早出现是在幼虫发育末期,分化和生长从预蛹早期开始,细胞分裂的高峰期出现在蛹发育早期( P1 - P3) ,尤其在蛹发育的第 1 天,在这个时期,细胞排列成多层,几乎所有的细胞都在快速增殖,上颚腺的体积也在不断增加,胞外管开始出现。上颚腺的早期发育特点同蜜蜂属的其他种类类似( Lensky and Cassier,1995; Salles and Cruz-Landim,2004) 。在无刺蜂 M. quadrifasciata anthidioides 蛹发育的中期,上颚腺狭长腺体的前背侧,有一些细胞会从上皮层分离出来,形成独立的分泌细胞( Cruz-Landim andMello,1967) ,这同蜜蜂属种类由腔壁细胞直接分化形成分泌细胞的方式有较大差别。
在中华蜜蜂上颚腺的发育过程中,上颚腺的体积会不断增加,但是体积增加的原因却有所不同。在蛹发育早期( P1 - P4) ,上颚腺体积的增加主要是基于细胞的快速分裂,而无刺蜂种类则主要是来源于细胞体积的增加( Cruz-Landim and Mello,1967) 。
到了蛹发育的晚期( P5 以后) ,中华蜜蜂上颚腺体积的增加也主要来源于分泌细胞体积的增加,此外还和细胞排列方式的改变有关,此时细胞由多层变为单层排列,因此,上颚腺在这个时期体积增加较为迅速。从组织切片上看,中华蜜蜂上颚腺的发育是从下往上进行的,下部靠近上颚的部分细胞较早停止增殖( P4) ,而上部则在 P6 以后才逐渐停止分裂。
在工蜂羽化时,上颚腺的发育基本完成。工蜂从巢内工作到出房采集的过程中,上颚腺的外部形态以及面积基本保持不变 ( Gracioli-Vitti and Abdalla,2006) 。此外在中华蜜蜂上颚腺的胚后发育过程中,未观察到细胞的凋亡。蜜蜂上颚腺内膜的形成过程较为特殊,它在蛹发育的第 1 天就已经开始出现,从组织结构上看,是许多腺体壁细胞胞质向管腔中延伸,细胞膜联合在一起所形成的,在延伸的胞质中充满了空泡。最初形成的膜光滑而平整,逐渐地它们和腔壁细胞的距离加大,形成波浪状。到蛹发育的第 5 天,胞膜连同胞核一起从腺体壁上分离下来,成为独立的内膜细胞,整个细胞变得扁平,胞核小,圆球形。到蛹发育的末期,内膜细胞核变得扁平,但是依然紧挨着分泌细胞形成的腔壁,这个过程同 Vallet 等( 1991) 对西方蜜蜂的研究一致。BrdU 标记实验没有显示内膜细胞的分裂增殖,推测它们可能是由腔壁细胞分化、迁移而形成的。在分泌细胞和内膜之间能看到大量的胞外管,但是在内膜外的腺腔中却看不到,说明内膜对胞外管有阻隔的作用。在蜜蜂上颚腺开始形成分泌物时,分泌物会从胞外管注入分泌细胞和内膜之间的空间暂时储存起来,等到蜜蜂成熟以后,它们才会进入分泌腔,并被分泌到外界去。
