最近研究发现 , DACT 1（Dapper1/Dpr1） 基因是一个肿瘤相关基因 , 其在调节肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移中起重要作用。有研究提示 , 在非小细胞肺癌中 DACT 1 的表达与肿瘤病理分级、大小、侵袭及转移有关。鼻咽癌中DACT 1 的表达情况及其与鼻咽癌的发生、发展及转移的关系还未见报道。本研究将通过改变 DACT 1 甲基化状态改变其表达情况 , 观察 DACT 1 基因在鼻咽癌细胞侵袭中的作用。
1材料与方法
1. 1细胞培养 CNE 2细胞购于中国生命科学院上海细胞所 , 在 5% 二氧化碳、37℃的条件下 , 用含 10% 胎牛血清的1640 培养基培养。在细胞处于对数生长期时用胰蛋白酶消化后分离 CNE 2 细胞 , 然后以等量接种在六孔板上 , 第 2 天 ,将六孔板中的 6 孔随机分为两组 , 一组用 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸处置 , 另一组不加任何药物 , 药物作用 1 d 后更换培养基继续培养 , 2 d 后收获细胞用于后续实验。
1. 2甲基化特异性 PCR 上述细胞收获后用 DNA 提取试剂盒提取各组细胞的 DNA, 然后用 DNA 甲基化试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰 , 根据 GeneBank 中 DACT 1 基因序列用甲基化引物设计软件分别设计甲基化和非甲基化引物序列。甲基化引物序列 （M） :5-CGGGATAGTAGTAGTCGGC-3（S），5-CGCTAAAACTACGACCGCG-3（R）， 非甲基化引物（U）：5-GTTGGGATAGTAGTAGTTGGT-3（S）， 5-AAACACTAAAACTACAACCACA-3.分别用两种引物对上述亚硫酸盐修饰的各组细胞的 DNA 进行扩增 , 退火温度分别是 60℃ （ 甲基化 ） 和58℃ （ 非甲基化 ）。分别取 PCR 产物 10 μl 用 2% 琼脂糖凝胶电泳 , 观察 DACT 1 基因甲基化情况。
1. 3RT-PCR 采用 TRIzol 试剂提取上述细胞的总 RNA, 用逆转录酶进行反转录形成DNA第一链（cDNA）。根据GeneBank中基因序列分别设计 DACT 1 和 β-actin 两对引物 , 分别以cDNA 为 模 板 行 PCR.DACT 1 引 物 :5-GGAAGAGGACAGGCTTGGAAAC-3（S）， 5-GTCCCATTGTTCAGAGAAGGTATC-3（R）；β-actin引物：5-CACCCAGCACAATGAAGATCAAGAT-3,5-CCAGTTTTTAAATCCTGAGTCAAGC-3, 退 火 温 度 均 是60℃。反应结束后取 PCR 产物 5 μl 用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳 ,观察 DACT 1 表达情况。
1. 4细胞侵袭实验 （transwell 小室法 ） 将对照和加药处理24 h 的细胞消化制成 105 个 /ml 悬液 , 取 1 ml 细胞悬液于1500 rpm 离心 5 min, 弃上清。加入 200 μl 无血清培养基 , 吹打均匀后放入 transwell 小室中。 Transwell 板中加入 500 μl含 10% FBS 1640 的完全培养基 , 将小室放入板中。37℃下于 5% CO2培养箱中培养 24 h.将小室取出 , 用 PBS 洗去培养基 , 结晶紫染色 10 min, 自来水将表面的结晶紫洗除干净 ,用棉签将上室中的细胞擦除干净 , 于倒置显微镜下观察 , 每组细胞随机取 10 个视野记录细胞数 , 分析观察两组细胞侵袭能力。
1. 5统计学方法 采用 SPSS17.0 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差 （ x-±s） 表示 , 采用 t 检验；计数资料以率 （%） 表示 , 采用χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2结果
甲基化特异性 PCR 结果显示 , 未经 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的CNE 2细胞中DACT 1基因是非甲基化的， 而经过S-腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的 CNE 2 细胞中 DACT 1 基因是甲基化的 , 这说明 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸能使非甲基化的 DACT 1基因重新甲基化。
RT-PCR 结果提示 , 在未经 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的 CNE 2 细胞中 DACT 1 高表达 , 而在经过 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的 CNE 2 细胞中 DACT 1 不表达 , 这说明 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸通过改变 DACT 1 基因的甲基化状态而改变了其表达。
transwell 小室实验结果显示 , 未经 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的 CNE 2 细胞侵袭数 （χ2=13.50±2.15） 明显多于经过 S-腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的 CNE 2 细胞侵袭数 （χ2=8.50±1.08,t=5.868, P<0.001）。这说明 DACT 1 的表达情况影响 CNE 2 细胞的侵袭能力。
3讨论
DACT 1 基因定位于 14q22.3, 其编码 836 个氨基酸的蛋白质 , 氨基端有 1 个亮氨酸连接区域 , 羧基端有 1 个 PDZ 连接位点。最近研究发现 , 其是 1 个肿瘤相关基因 , 其可能通过增强 Bata- 连环蛋白的表达 , 影响 Wnt 信号转导途径 , 调节细胞周期及凋亡 , 进而调节肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移。Yuan 等[1]研究发现 , DACT 1 在结肠癌细胞中的高表达能促进癌细胞的生长、增殖、迁移及侵袭能力。有研究认为[2], 在 B 细胞慢性淋巴细胞白血病细胞中 DACT 1 的高表达与其基因低甲基化有关。
DNA 甲基化是基因表观遗传学修饰的一种重要方式 , 即在 DNA 序列不变的情况下调节某些特定基因组区域的转录活性 , 控制该基因的表达[3].基因启动子区 CpG 岛甲基化状态与基因的活性有关 , 启动子区域 CpG 岛高甲基化是基因失活的主要原因之一。先前研究发现 , 抑癌基因 DAPK 及肿瘤转移相关基因 uPA 的表达与其基因启动子区 CpG 岛甲基化状态有关 , 且这些基因的甲基化状态是可逆的 , 可通过调节某些酶的活性改变这些基因的表达 , 进而影响鼻咽癌及喉癌细胞的生长及侵袭能力[4].本研究结果显示未经 S- 腺苷 -L-甲硫氨酸处理的 CNE 2 细胞中 DACT 1 基因启动子区非甲基化 , DACT 1 高表达 , 而经 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸处理的 CNE2 细胞中 DACT 1 基因启动子区高甲基化 , DACT 1 不表达 ,且 CNE 细胞的侵袭能力明显减弱。说明 S- 腺苷 -L- 甲硫氨酸在 DNA 复制过程中能使去甲基化的基因重新甲基化而失去表达 , 根据失活基因的功能而调节细胞的生长及侵袭 , 进而在肿瘤生长、侵袭及转移中起重要作用。
综上所述 , DACT 1 基因甲基化状态与其表达有关 , 可以通过改变其甲基化状态改变其表达 , 进而调控肿瘤细胞的生长及侵袭 , 进而调节肿瘤的进展。
参考文献：
[1] Yuan G, Wang C, Ma C, et al. Oncogenic Function of DACT 1 inColon Cancer through the Regulation of b-catenin. Plos One, 2012,7（3）：1-17.
[2] Kong WJ, Zhang S, Guo CK, et al. Effect of methylation-associated silencing of the deathassociated protein kinase gene onnasopharyngeal carcinoma. Anti-Cancer Drugs, 2006, 17（3）：251-259.
[3] 张松 , 李烁 , 高春生 . uPA 基因启动子区低甲基化在鼻咽癌侵袭转移中的作用 . 肿瘤防治研究 , 2012, 39（6）：691-693.
[4] 叶星星 , 蔡志毅 , 陈佳玉 , 等 . 细胞周期素 G 在鼻咽癌细胞中的表达及其意义 . 中国卫生检验杂志 , 2010（11）：165-166.
