鼻咽癌( NPC) 是一种恶性上皮肿瘤，具有显着的地域性和种族性。在我国广东省，鼻咽癌的发病率居于世界首位，每年平均 10 万人中就有 30 ～ 80 例患病。目前多采用放射性治疗鼻咽癌，但癌细胞的辐射抗性可导致治疗失败，肿瘤局部失控或复发。因此，如何逆转肿瘤的辐射抗性是鼻咽癌治疗所面临的新问题。
细胞角蛋白( Cytokeratins) 因在组织发生恶变后会出现差异性表达，被广泛应用于肿瘤的诊断。其中，角蛋白 13( Keratin-13，KRT13)已经在各 种 癌 症 中 发 现，同 时 有 研 究 认 为它与细胞的放射敏感性有关。本研究首次构建反义 KRT13 慢病毒质粒，筛选出稳定转染该慢病毒的鼻咽癌细胞株 anti-KRT13-HNE-1，并进一步探讨反义 KRT13 质粒对鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响，为鼻咽癌新的基因 － 放射联合治疗提供理论基础。
1 材料与方法
1 ． 1 实验材料人鼻咽癌高分化鳞癌细胞株 HNE-1 由湘雅医学院肿瘤中心提供。pLV-EGFP 慢病毒载体及包装系统购自北京英茂盛业生物科技有限公司。pUC57-KRT13 由本科室构建。G418和 PI 购自美国 Sigma 公司。Trizol 购自 Invitro-gen 公司 。 cDNA 第一 链 合 成 试 剂 盒 和 荧 光 定量 PCR 试 剂 盒 均 购 自 北 京 天 根 生 化 公 司。
KRT1 3 和 β -actin 小 鼠 一 抗 、HRP 标 记 羊 抗 小鼠二抗均购自美国 Santa Cruz 公司。RIPA 裂解液、ECL 化学发光试剂盒和 Annexin V-FITC / PI细胞凋亡检测试剂盒均购自碧云天公司。
1 ． 2 细胞培养人鼻咽癌高分化鳞癌细胞株 HNE-1 用含1 0 % 胎 牛 血 清 的 RPMI 1 6 4 0 培 养 基 ，置 于3 7 ℃ 、5 % CO2饱和湿度培养箱内培养。
1 ． 3 质 粒构建反义 KRT13 设计的带有酶切位点引物，上游: ( BamHI ) GGATCCGCACCTGCTCTCAAT，下游: ( AplI ) GGGCCCAACCCCCACCAAAGCCA，采用 PCR 法从已有的质粒模板 pUC57-KRT13 中扩增出所要的片段，随后用 BamHI 和 AplI 双酶切并回收，用 T4 连接酶与 pLV-EGFP 慢病毒质粒反向连接过夜得到连接产物。根据 pLV-EG-FP 慢病毒包装系统说明书进行操作 。
1 ． 4 细胞感染及筛选稳定表达反义 KRT1 3 细胞系PBS 稀释上清 ，并依照文献测定病毒滴度。将病毒依照滴度测定的量感染 HNE-1 细胞 3 次，并定期在荧光显微镜下观察，当细胞均出现绿色荧光后即得到稳定的细胞株用于后续实验。
1 ． 5 各组细胞中 KRT1 3 的检测按数 字 随 机 法 将 细 胞 分 为 control ( 正 常HEN -1 细胞 ) 组 、lentivirus ( 转染慢病毒空载体 )组和 anti-KRT13 ( 转染慢病毒质粒组) ，以 Tr-izol 法提取总 RNA ，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，取 2 μl mRNA 使用 cDNA 逆转录试剂盒合成 cDNA 第一链，按照荧光定量试剂盒说明对各组细胞的 cDNA 进行相对定量检测。扩增条件: 变 性 95℃ 2 min; 95℃ 15 s，60℃ 30 s( 35 个循环) ; 溶解曲线阶段依照仪器说明设定。结果采用 2-ΔΔCt 方法进行 mRNA 表达差异分析。
收集各组对数生长期细胞，RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法进行定量检测。聚丙烯酰胺 凝 胶 电 泳 ( SDS-PAGE ) 后 将 蛋 白 转 移 至PVDF 膜上 ，5 % 脱脂奶粉封闭 1 h ，加入小鼠一抗后 4℃ 过 夜 孵 育，TBST 洗 膜 3 次 ( 5 min /次) ，加入稀释的 HRP 标 记 羊 抗 小 鼠 二 抗，室温孵育 2 h; TBST 洗膜 3 次( 5 min / 次) 后，进行化学发光检测。β-actin 作为内参进行 进 一步处理。
1 ． 6 细胞辐射选取指数生长期细胞，经 0． 25% 胰酶消化制成单细胞悬液，计数细胞浓度，按预定数量接种于 6 孔板中，置于培养箱中孵育 12 h 后，采用 Varian 2300 EX 直线加速器 6MV-X 线照射，剂量率 400 cGy / min，垂直辐射细胞，细胞上面覆盖 1 cm 有机玻璃填充物帮助剂量建成，固定源皮距 SSD 100 cm，照射野面积 10 cm ×1 0 cm 。
1 ． 7 细胞周期实验指数生长期细胞经 2 Gy 照射 24 h 后进行收集，加入 70% 冰 乙 醇 中 4℃ 过 夜，PBS 洗 涤3 遍后 ，避 光 将 细 胞 加 入 到 含 有 5 0 μg / ml 的RNA 酶 和 50 μl / ml PI 染 色 液 中 ，室 温 孵 育30 min 后 ，流式细胞仪检测细胞周期各时相所占比例。
1 ． 8 细胞凋亡检测指数生长期细胞经 2 Gy 照射 24 h 后，胰酶消化并用 PBS 洗涤 3 遍，重悬细胞离心后弃上清，加入 190 μl Annexin V-FITC 溶液轻轻重悬细胞，室温孵育 10 min 后，再加入 5 μl 碘化丙丁( PI) 染色液，轻轻混匀。冰浴避光放置。随即进行流式细胞术检测。
1 ． 9 克隆形成实验3 组细胞按预定数量接种于 6 孔板中 ，每组均设 0、1、2、4、6、8 Gy 6 个剂量组，每一剂量组 3 个复孔。照射后的细胞置于 37℃ 、5%CO2培养箱内培养。当出现肉眼可见克隆时，终止培养，2 ml 甲醇固定 15 min，4% 吉姆萨溶液染色 10 ～ 30 min，去染色液，自然干燥。显微镜下计数含 50 个细胞以上的克隆数，计算克隆形成率( planting efficiency，PE，克隆形成率= 克 隆 数 / 接 种 细 胞 数 × 1 0 0 % ) 和 存 活 分 数( surviving fraction，SF，存活分数 = 受照射细胞的克 隆 形 成 率 / 对 照 细 胞 的 克 隆 形 成 率 ×1 0 0 % ) 。 以 3 次照射的存活分数均值进行分析，运用 GraphPad Prism 6． 0 软件进行多靶单击模型和线性二次模型曲线拟合，绘制剂量存活曲线，并计算多靶单击模型参数 D0、Dq、和 N和线性二次模型参数 α、β、α / β、SF2 ( survivalfractionat 2 Gy ) 。
1 ． 1 0 统计学分析采用 SPSS 16． 0 软件进行统计分析，实验数据以 x珋 ± s 表示，各组间的比较采用单因素方差分 析 ( One-way ANOVA) 或 独 立 样 本 的 t 检验，以 P ＜ 0． 05为差异具有统计学意义。
2 结果
2 ． 1 质粒构建 、感染及稳筛细胞系的建立构建含有 KRT13 反 义 序 列 的 慢 病 毒 质 粒经测序比对确认正确后，共转染 293FT 细胞得到含有慢病毒的上清液，测定滴度后感染 HNE-1 细胞，经过 G418 筛选后得到稳筛细胞系 。
2 ． 2 反义 KRT1 3 鼻咽癌细胞株的鉴定RT -qPCR 检测 3 组细胞中 KRT1 3 的 mRNA表达水平，结果( 图 1A) 显示: 与正常细胞组相比，空载体组为正常细胞组的 1． 011，无明显差异( P ＞ 0． 05) ; 质粒组为正常细胞组的0．284，表达明显降低( P ＜ 0．001) 。Western blot 的检测结果从蛋白水平上确证了这一结果( 图1B) 。【图1】
2 ． 3 细胞周期和凋亡检测流式细胞仪分析结果表明( 图 2、3) ，照射前正常细胞组、空载体组、质粒组的细胞周期图 1 反 义 KRT13 慢 病 毒 质 粒 对 HNE-1 细 胞 内KRT1 3 表达量的影响 A : Realtime PCR 检测各组细胞中 KRT13 的 mRNA 表达情况; B: Western blot 检测各组细胞 KRT13 蛋白表达情况中，G0 / G1 以及 S 期均无显着性差异，但 G2 / M期细胞比例略有差别，分别为( 10．67 ±0．91) % 、( 10． 74 ± 0． 24 ) % 和 ( 13． 04 ± 0．80 ) % ( P =0． 123 ) 。照射 2 Gy 24 h 后，G2 期细胞比例均显着升 高，分 别 为 ( 29． 42 ± 1．75) % 、( 28． 74 ±1． 07 ) % 和 ( 39 ． 20 ± 1． 40 ) % ，3 组细胞均出现G2 / M 期阻滞，且质粒组更为明显 ，与其他组相比差异具有统 计 学 意 义 ( P 均 ＜ 0． 05 ) ，说 明KRT1 3 沉默后显着增加了辐射引起的细胞 G2期阻滞。此外，细胞凋亡分析 结 果 表 明，2 Gy照 射 24 h 后，质 粒 组 细 胞 凋 亡 率 ( 8． 74 ±0． 80 ) % 较正常细胞组 ( 2 1 ． 4 5 ± 0 ． 4 9 ) % 及空载体组( 21． 46 ± 0． 64 ) % 的细胞凋亡率下降，差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。【图2-3】
2 ． 4 KRT1 3 沉 默 后 降 低 鼻 咽 癌 HNE -1 细 胞体外放疗敏感性3 组细胞经过 X 射线照射后 ，依据各剂量组克 隆 数 计 算 出 克 隆 形 成 率 和 存 活 分 数( 图 4) ，并应用 GraphPad Prism 6． 0 软件进行曲线拟合，绘制出存活曲线( 图 5、6 ) ，求出多靶单击模型及线性二次模型各放射生物学参数，并统计分析( 表 1) 。【表1】
图 4 结果表明，转染反义 CK13 组的克隆形成数和形成率明显大于空载体组和正常细胞组，且差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。图 5、6 结果表明，X 线照射后，正常细胞组和空载体组的各组放射生物学参数均相似，说明两组细胞的放射敏感性无显 着 性 变 化。而在相同放射剂量下，与空载体组和正常细胞组相比，转染反义 CK13 基因后的细胞存活分数升高，可以看出，转染反义 CK13 基因后，D0、Dq 、SF2 均 增 加 ，α 值 、α / β 均 减 小 。 说 明CK1 3 基因的沉默减低了 HNE1 细胞的放射敏感性( 表 1) 。【图4略.图5-6】
3 讨 论
KRT1 3 基因是非角化复层鳞状上皮细胞分化的标 志，KRT13 与 KRT4 结 合 在 一 起，形 成绝大 多 数 腔 内 复 层 鳞 状 上 皮 的 主 要 角 蛋 白网，通常 KRT13 基因只表达在非角化复 层鳞状上皮的浅层，如鼻咽、舌、食管及泌尿系统上皮等，但这些部位的肿瘤 KRT13 基因多表达异常，邱元正等采用免疫组化及 North-ern -blot 方法检查 发 现 ，鼻 咽 癌 中 KRT1 3 表 达下调; 王 亚 利 等采 用 芯 片 分 析 发 现 鼻 咽 癌CNE -2 细胞骨架相关蛋白中 ，KRT1 3 基因表达下调，他们认为放射线改变了细胞形态，影响细胞的信息传递，改变肿瘤细胞的稳定性，从而改变了细胞的放射敏感性。这 提 示 我 们 在分子靶向治疗尚无法完全取代放化疗等经典治疗方 法 之 时，充 分 利 用 这 种 协 同 和 增 敏 作用，实现提高放疗疗效与减少副作用，将更具临床应用意义。
目前，鼻咽癌公认和有效的治疗方法为放射治疗或以放疗为主的综合治 疗。尽 管 很 多研究表明反义寡核苷酸和 RNAi 干扰对鼻咽癌细胞放射敏感性具有一定影响，但是由于其在体内运送过程中易被降解限制了二者的应用。
反义核 酸 作 为 基 因 治 疗 药 物，具 有 高 度 特 异性、高效性、低毒安全等优点，是一种优化的药物设计。采用慢病毒作为载体可 感 染 非 分 裂期细 胞，实 现 细 胞 的 稳 定 表 达，可 容 纳 复 杂DNA ，是相对理想的基因治疗载体。
本研究首次 尝 试 以 KRT13 基 因 中 合 理 的反义 序 列 为 对 象，成 功 构 建 慢 病 毒 载 体，将KRT1 3 的 反 义 RNA 导 入 鼻 咽 癌 HNE -1 细 胞中，通过 G418 筛选出稳定表达反义 KRT13 片段的 鼻 咽 癌 HNE-1 细 胞。RT-PCR 和 Westernblot 检测结果也证实了该细 胞 中 KRT1 3 的 表达明显下调。我们进一步采用克 隆 形 成 实 验及曲线拟合分析了反义 KRT13 鼻咽癌HNE-1细胞的辐射敏感性。D0 值 愈 大，细 胞 对 放 射 愈抗拒; Dq 反映亚致死性损伤修复能力的大小，Dq 值小则修复能力弱 ; α 值决定低剂量照射下损伤的程度，α 值越大，说明细 胞 对 辐 射 越 敏感，β 值的贡献随照射剂量增 大 而 增 大，组 织的 α / β 值 高，对 损 伤 修 复 能 力 弱。研 究 结果显示，与正常细胞组和转染空载体组相比，转染质粒组的 SF2 值明显增加，放射增敏比为1 ． 4 0 1 4 ，D0 、Dq 值 均 明 显 偏 高 ，P 值 分 别 为0． 002 和 0 ． 0 0 3 ，α / β 值显着降低 ，说明 KRT1 3沉默后细胞对放射损伤的修复能力增强，反而降低了 HNE-1 细胞的放射敏感性。这从另一个方向证明了 KRT13 的调控可以影响鼻咽癌细胞的放射敏感性。
为进一步研 究 KRT13 影 响 放 疗 敏 感 性 的可能机制，我们采用流式细胞仪对照射前后的细胞周期和细胞凋亡变化进行 了 检 测。本 研究结果显示 HNE-1 细胞在辐射 24 h 后均出现G2 / M 期阻滞 ，但转染质粒组 G2 / M 期较正常细胞 组 显 着 升 高。 辐 射 可 以 引 起 肿 瘤 细 胞DNA 的损伤 ，常常导致细胞阻滞在 G1 期或 G2期进行修复，以防止细胞进入下一个周期复制受损的 DNA 或进行异常分裂。
尽管很多研究表明角蛋白的特异性表达是一些癌症的标志，但是角蛋白如何影响肿瘤的发生尚不明确。有报道表明角蛋 白 在 癌 症 中的异常表达常与 AKT / mTOR 有关，此通路本身常在浸润性肿瘤中被激活，提高了部分角蛋白介导的 AKT 在上皮肿瘤发生中有重要作用的可能性。角蛋白还与 PKC 有相互作用，最近的研究表明，一些角蛋白的分化特异性可能涉及到了 PKC / AP-1 信号通路。此外，降低NOTCH1 的 表 达 也 会 调 控 KRT1 3 的 表 达 下调。这些都表明了角蛋白在细胞中作为分子伴侣的支架重要作用。
本研究结果 说 明 KRT13 可 能 是 一 个 鼻 咽癌辐 射 敏 感 性 相 关 的 调 控 因 子，转 染 反 义KRT1 3 慢病毒降低了鼻咽癌细胞株 HNE -1 的辐射敏感性。这从另个一侧面为 鼻 咽 癌 新 的基因 － 放射联合治疗提供了理 论 基 础。下 一步我们将在动物模型验证反义 KRT13 的鼻咽癌 HNE-1 细胞株对辐射敏感性的影响，同时对KRT1 3 的作用分子机理进行深入研究 ，希望能为临床应用及靶向治疗带来新的思路。
参考文献:
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