原发性痛经在妇科病症中是常见病、多发病,常常影响人们工作、学习和健康,因此,引起人们的广泛关注,其发病机理有待于进一步研究。经前止痛方是以《删补名医方论》所载佛手散为基础,临床加减使用治疗原发性痛经的方剂。处方中把当归和川芎按照 3 ∶ 1 比例配伍,重用当归为君药活血、养血、补血、和血对血瘀血虚之疼痛均有“通”和“荣”之效,并配以益母草、赤芍和桂枝等。以川芎、益母草为臣,行血活血,行气之郁,活血之瘀,共同起到养血和血行气化瘀止疼之效。赤芍凉血消肿、化瘀止痛为佐; 以桂枝温通为使,缓拘急而止疼。全方共同起到养血行血和血,调经行瘀止痛的作用。JQF 临床用药特点是,只在月经前 3天使用本次月经无疼痛,连续服用 3 个月经周期,从第四个月经周期起停止服药,连续追踪 3 个月经周期,复发率低于4%。JQF - A - N - 30、JQF - A - E 是 JQF 的两个活性部位,本实验在前期研究基础上,为深入探讨该药的作用机制,并进一步了解前列腺素及雌激素、缩宫素受体在PD 中的发病机理,本实验以阿司匹林为对照药,观察两个有效部位对痛经大鼠子宫组织前列腺素含量、雌激素受体(ER) 、缩宫素受体(OTR) 相关的影响。
1、 实验材料
1. 1 实验动物
SD 雌性健康大鼠,未孕,体重选择在 180 ~ 220 g 之间,在天津中医药大学二级动物实验室(实验动物中心) 条件下饲养。提供单位: (合格证号: SCXK(京) 2010 - 0002) 中国医学科学院放射医学研究所动物室。
1. 2 药物与试剂
JQF 基础方(当归、益母草、川芎、赤芍、桂枝) ,购自天津保康医院,并经生药学鉴定。
JQF - A - N - 30 的制备: 上述配方取各味生药,粉碎后用水煎煮 3 次,每次 2 h。滤液合并后浓缩并进行大孔树脂柱层析分离,依次以水、30% 乙醇洗脱,30% 乙醇洗脱部位经浓缩,冷冻干燥为 JQF - A - N -30,出膏率为 1. 98%。
JQF - A - E 的制备: 按上述配方取各味生药,粉碎后用 95%乙醇加热回流提取两次,每次 2 h,过滤后合并 95%乙醇提取液,将乙醇提取液浓缩至无醇味,得乙醇提物 JQF- A。将此醇提物经乙酸乙酷萃取,萃取液浓缩得 JQF - A- E,出膏率为 2. 77% 。
上海一化药业有限公司生产的缩宫素注射液(10 IU,1mL) ,(批号: 040912) ; 天津金耀氨基酸有限公司生产的己烯雌酚(diethylstilbestrol) 注射液(0. 5 mg,1 mL) ,(批号:0806021) ; 石药集团欧意药业有限公司生产的阿司匹林肠溶片25 mg/片(批号: 018100725) ; 大鼠前列腺素 F2α(PGF2α)ELISA 试剂盒(批号 20110701A) ,大鼠前列腺素 E2(PGE2)ELISA 试剂盒(批号 20110701A) ,均购自上海宝曼生物科技有限公司; 2* taq plus PCR masterMIX(批号 K9104) ,QuantcDNA 第一链合成试剂盒(批号: K9411) : 天根生化科技有限公司; PCR 反应引物、1000 bp DNA Ladder Marker: TaKaRa 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1. 3 仪器设备
匀浆机: IKA T -18 basic; MVS -1,由北京北德科学器材有限公司生产的涡旋混合器; PCR 扩增仪(HYBAID) ;离心机(美国 BECKMAN) ; 电泳仪(北京六一仪器厂) ;SYNGENE,GENE GENIUS 凝胶成像分析仪。BECKMAN 核酸蛋白分析仪,美国。
2、 实验方法
2. 1 制作模型和分组灌胃
制作雌性大鼠痛经模型: 选取体重 180 ~220 g 健康雌性大鼠(未孕) ,连续 10 d 己以己烯雌酚皮下注射,第 1、10两天皮下注射给药量为每只每天 0. 5 mg,其余 8 日均为每只每天 0. 2 mg,末次己烯雌酚注射后间隔 40 h,腹腔注射缩宫素 2U/只(生理盐水稀释) 。
将大鼠分为 JQF - A - N -30 组、JQF - A - E 组、模型对照组、阿司匹林对照组、正常对照组。JQF - A - N - 30组、JQF - A - E 组每天每只大鼠灌胃给予浓度为 1. 5 g/mL的浸膏干粉 1 mL,阿司匹林对照组每天每只大鼠灌胃给予浓度为 5 mg/mL 的阿司匹林片 1 mL,正常对照组、模型组每天灌胃等体积生理盐水,即连续 10 d,每天灌胃 1 次。
2. 2 子宫组织 PGF2α、PGE2含量测定末次给予缩宫素 1 h 后,将大鼠脱臼处死,解剖,分离出子宫,精确称取各组动物同侧同位段新鲜子宫 150 mg,生理盐水冲洗两次,加匀浆液(无水乙醇∶ 生理盐水 =1 ∶ 9)2 mL,以 3000 r / min,立即匀浆,离心 10 min(4℃) ,提取上清液体。用 ELISA 法测定 PGF2α、PGE2。
2. 3 RT - PCR 法考察 JQF 活性部位干预对子宫组织OTR、ER - α 表达的影响2. 3. 1 引物序列与扩增片段长度见表 1。
2. 3. 2 提取 RNA 和逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)子宫组织 RNA 的提取: 称取子宫组织80 ~90 mg,按试剂盒说明书提取总 RNA。使用核酸蛋白分析仪对提取的 RNA含量及纯度进行计算。RT 反应: 建立 20 μL 反应体系,使用 PCR 仪反应 1 h(37℃) 。RT - PCR 反应: 建立 25 μL 反应体系,在 RT - PCR 仪上检测各样本基因表达(条件见表1) ,以 β - actin 作为内参照,取 PCR 产物,琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下检查有无特异性条带。在凝胶图像处理分析系统中扫描电泳带,以 RNA 含量 = (目的基因—β - ac-tin) / β - actin 为公式,统计电泳带的积分值。
3、 统计方法
使 SPSS 11. 5 统计软件进行数据处理,实验数据以 x珋 ±s 表示,采用单因素方差分析 LSD 方法统计,组间比较用Dunnett't 检验。
4、 结 果
4. 1 JQF 活性部位对痛经模型大鼠子宫中 PGF2α、PGE2含量变化的影响6结果表明,模型组大鼠子宫组织 PGF2α含量明显高于正常对照组,与模型组比较,阿司匹林阳性对照组、JQF - A- N - 30 的 PGF2α含量具有显著性差异 (P <0. 01) ,JQF -A - E 的 PGF2α含量亦有差异 (P <0. 05) ; 模型组大鼠子宫组织 PGE2含量明显高于正常对照组,与模型组比较,阿司匹林阳性对照组、JQF - A - N - 30、JQF - A - E 的 PGE2含量有差异 (P <0. 05) ,见表 2。
4. 2 JQF活性部位干预对子宫组织OTR,ER一。表达的影响见图1,表3。实验结果显示,模型组大鼠子宫组织OTR,ER一。基因表达较正常组明显上调,与模型组比较,阿司匹林阳性对照组、JQF - A - N - 30、JQF - A - E 的OTR、ER - α 基因表达均有所降低,结果见表 3。
5、 讨 论
现代医学研究发现,原发性痛经可能与 ER、PG、OTR等因素有关,本实验采用酶免法对照观察了痛经大鼠子宫前列腺素含量(PGF2α、PGE2) 的变化,RT - PCR 法检测了OTR、ER - α 的变化,结果表明,JQF 活性部位可显著降低ER、PG、OTR 水平。
病理状态下 E2是促进子宫对 OT 的敏感性的重要物质,而且 E2可增加大鼠子宫和人蜕膜培养物中缩宫素基因的表达。OT 直接作用在大鼠子宫平滑肌细胞引起宫缩,子宫内膜细胞受到影响后使 PGs 水平升高,形成和加重疼痛。JQF 活性部位可使 PGF2α所致的大鼠子宫肌痉挛直接得到抑制,有效缓解疼痛。实验显示: 降低大鼠子宫组织PGF2α水平是 JQF 活性部位治疗原发性痛经的作用机制。
前期二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验,热刺激所致小鼠疼痛实验,痛经模型小鼠扭体反应实验和大鼠离体子宫实验等实验已经证明 JQF - A - N -30、JQF - A - E 可以显著抑制 PGF2α和缩宫素引起的子宫平滑肌条剧烈收缩,尤其对收缩频率加快的抑制作用较强,同时具有抗炎作用。本次实验通过 ELISA 法和 RT - PCR 法使其得到进一步验证。
参考文献：
[1] 方玲,尹菊,赖晓艺,等. 经前三剂止痛方治疗原发性痛经疗效观察[J]. 中华中医药学刊,2011,29(11) : 2480 -2481.
[2] 方玲,朱新冰,尹菊,等. 经前三剂止痛方治疗实验性痛经模型大鼠作用机制研究[J]. 天津中医药,2010,27(1) : 46 -49.
[3] 方玲,朱新冰,祝诚诚,等. 经前三剂止痛方治疗原发性痛经的机制研究[J]. 中草药,2010,41(4) : 615 -617.
[4] Donghao Wang,Jolanta Gutkowska,Mieczyslaw Marcinkiewicz,etal. Genistein supplementation stimulates the oxytocin system inthe aorta of ovariectomized rats[J]. Cardiovascular Research,2003,57: 186 - 194.
[5] 刘芳,郑翠红,黄光英,等. Cx43 对针灸治疗原发性痛经大鼠效应的影响[J]. 中国针灸,2008,28(10) : 751 -755.
[6] 宋卓敏,屈彩芹,张远,等. 痛经宁颗粒对痛经大鼠子宫雌、孕激素受体的影响[J]. 中华中医药杂志,2006,21(1) : 35 -38.
[7] R Chibbar,S Wong,FD Miller,et al. Estrogen stimulates oxyto-cin gene expression in human chorio - decidua [J]. J Clin En-docrinol Metab,1995,80: 567 - 572.
[8] 孙绪美,姜国云,赖晓艺,等. 经前三剂止痛方治疗痛经活性部位的筛选[J]. 天津中医药大学学报,2011,30(4) : 220 -224.
